一种通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法技术

本发明专利技术属于分子生物技术领域，涉及基于ＰＣＲ的小麦品质性状分子标记的通量实用检测方法。该方法选用ＮｕｌｌＡｘ（Ｇｌｕ－Ａ１位点）、Ｂｘ７ＯＥ（Ｇｌｕ－Ｂ１位点）和Ｄｘ５（Ｇｌｕ－Ｄ１位点）亚基基因的特异分子标记，通过优化ＰＣＲ反应体系和热循环条件，建立起一次反应能同时鉴定Ｇｌｕ－１位点上重要优质亚基的多重ＰＣＲ体系，且普通琼脂糖电泳能有效分离特异扩增产物。较之单一ＰＣＲ反应，该方法检测效率大大提高，经品种和群体验证，鉴定结果可靠、重复性好，为育种材料评价和杂交后代高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物
，涉及小麦品质性状分子标记的实用检测方法，特 别涉及基于PCR技术的多个小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的快速鉴定。
技术介绍
蛋白质的数量和质量是影响小麦面粉品质的重要因素。小麦种子储藏蛋白主要 由麦醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)组成，麦谷蛋白又分为高分子量麦谷 蛋白亚基(H丽-GS)和低分子量麦谷蛋白亚(L丽-GS)，亚基间通过二硫键结合形成谷蛋 白大聚合体，赋予面团独特的粘弹性和延展性，可以加工成面包、面条和糕点等多种食品。遗传和生化研究表明，高分子量谷蛋白的组成和数量与小麦面包力口工品质密切相关。高分子麦谷蛋白基因位点 Glu-1位于第1同源群染色体长臂，在A、 B、 D组染色体上含有相应的Glu-Al、 Glu-Bl和 Glu-Dl同源基因复合位点，每个Glu-1位点又包含分别编码x-和y_型高分子麦谷蛋白 亚基的2个紧密连锁基因。 Payne首先建立了小麦高 分子量谷蛋白亚基(对)对面筋品质贡献的评分系统，如Axl/Ax2伞和Dx5是目前公认的 面包小麦优质亚基。研究表明，等位基因Glu-Blal编码的超表达Bx7亚基(Bx7QE)能显著提高面 筋强度[Butow BJ， Ma W， GaleKR， et al. Molecular discrimination of Bx7 alleles demonstrates that a highly expressedhigh_molecular_weight glutenin allele has a major impact on wheat flour dough strength. TheorAppl Genet，2003，107 :31524-1532]，含有Bx7GE的小麦育成品种或地方品种通常都具有更好的面筋强度。发掘和利用Bx7°E已成为进一步改良小麦品质的重要途径，目前 发达国家优质小麦育种计划正加强利用这一基因。 普通小麦中的Bx7^亚基来自南美的一个地方品种，中国小麦品种几乎不含 有这一亚基。通过杂交聚合育种引入Bx7，Dx5等优质亚基，是快速改良我国小麦品 质的有效途径。SDS-PAGE是分离和鉴定HMW-GS的传统方法，但不能有效鉴别分子 量大小和迁移率十分接近的亚基，且费工费时。近年来，随着大量的HMW-GS基因被克隆，主要等位 基因的DNA分子标记也相应被建立，利用连锁分子标记鉴定亚基组成更加方便、准确、可 靠。然而在我国现有育种条件下，相对表型鉴定而言，分子标记辅助选择技术因成本较高 未能真正用于育种实践。与单个基因分子标记的PCR鉴定方法相比，多重PCR(multiplex PCR)技术体系含有多个基因标记引物，通过一次反应能够对多个性状基因进行鉴定，实验 成本明显降低，工作效率显著提高。目前，用于小麦研究的多重PCR技术主要涉及与品质 相关的高(低)分子谷蛋白亚基基因、籽粒硬度基因和淀粉酶基因等，能够同时鉴定3个 Glu-l位点上重要优质亚基基因的多重PCR技术还未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种通量鉴定几个高分子量谷蛋白优质亚基的多重PCR实用 方法。 本专利技术提供的小麦高分子量谷蛋白优质亚基的分子鉴定技术，是通过选用3个 已经报道的AxNull、 Bx7°E和Dx5亚基基因的特异分子标记，通过优化PCR反应体系和热 循环条件而建立起来的。由于在Glu-Al位点通常只编码3种亚基，分别是Axl、 Ax2*和 Ax皿ll ，通过鉴定Ax皿ll可以间接判断优质亚基Axl/Ax2氺存 在与否，因此该方法经一次PCR和普通琼脂糖凝胶电泳检测，可鉴定4种优质亚基的有无。 经品种和群体验证，利用本专利技术检测品种(系)的结果可靠、重复性好，为小麦品质改良过 程中，育种材料和杂交后代高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、 准确的实用检测方法。 用于通量检测上述分子标记的多重PCR技术属于本专利技术的保护范围。 附图说明 图1. AxNull、 Bx7°E、 Dx5亚基组合不同的小麦品系多重PCR凝胶电泳 图。1是分子Marker (D2000) ， 2是CJ02 (AxNull) ， 3是CJ05(7°E)，4是CJ12(Dx5)， 5是CJ54(AxNull+Bx70E) ，6是CJ17 (AxNull+Dx5) ， 7是CJ25 (Bx70E+Dx5) ， 8是 CJ31(AxNull+Bx70E+Dx5) 图2.部分西藏小麦品种(系)优质亚基组成的多重PCR鉴定。l是分 子Marker(D2000)，2-4是XZ10， XZ35， XZ37(AxNull)，5是XZ69(Dx5)，6-7是XZ19， XZ14 (AxNull) ，8是XZ37(Dx5) ，9是XZ84 (AxNull) ， 10是XZ47 (AxNull+Dx5) ， 11-15是XZ28， XZ13， XZ54， XZ61， XZ57 (AxNull) ， 16是XZ42 (AxNull+Dx5) ， 17是XZ72 (AxNull) 具体实施方法 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例一 所需材料DNA的提取和检测以及PCR引物的选取 l.DNA的提取及检测 CTAB法从种子中提取小麦总DNA，利用紫外分光光度计检测总DNA的质量和浓度。 PCR引物序列 各分子标记的引物序列、目的片段大小等见下表 <table>table see original document page 5</column></row><table> 实施例二 多重PCR体系的建立 多重PCR反应体系总体积为25ul ，包括PCR Buffer (Mg2+Free) 、 1. 5mM MgCI2、 200uMdNTP、 1. 5U的Taq酶和150ng的模板DNA，亚基Bx7°E、 Dx5和AxNull特异分子标记的 上下游引物分别为5/5/8pmo1。由于3对引物其中一对的退火温度较高，所以采用一种类似 降落PCR的方法来优化扩增条件，最佳热循环条件为95t:预变性5min， 94"C变性30S， 62°C 退火30S，72。C延伸lmin，8个循环；然后94。C变性30S， 58。C退火30S，72。C延伸lmin，27个 循环；最后72t:延伸10min。采用该扩增程序可以富集引物与模板正确配对的产物，使每对 引物都能合成特异的扩增产物。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后用凝 胶成像系统观察并照相。 利用HMW-GS组成已知的7个小麦品种(系)验证Bx7°E、 Dx5和AxNull分子标记 多重PCR技术体系的准确性。结果表明，Glu-Al位点为Null的材料均能产生920bp的扩增 条带，Glu-Bl位点为Bx7°E的材料均能产生844bp扩增条带，Glu-Dl位点为Dx5的材料均能 产生476bp的扩增条带，以上条带与相应的单一 PCR扩增产物大小一致。图1示Bx7°E、Dx5 和AxNul 1不同亚基组合材料的多重PCR扩增带型，含有AxNul 1和Bx7°E两个亚基的品种中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法，其特征在于：ＰＣＲ体系同时含有Ｇｌｕ－Ａ１位点的ＮｕｌｌＡｘ、Ｇｌｕ－Ｂ１位点的Ｂｘ７↑［ＯＥ］和Ｇｌｕ－Ｄ１位点的Ｄｘ５亚基基因分子标记引物，经反应体系、扩增程序优化以及普通琼脂糖电泳分离特异扩增产物，一次反应能同时鉴定上述３个Ｇｌｕ－１位点上的优质亚基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈静，郑寒，付体华，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]