【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
1、丝状真菌里氏木霉(trichoderma reesei)是一种嗜温腐生性的丝状真菌，是纤维素酶、半纤维素酶的主要工业生产菌株。里氏木霉是美国fda认证的食品安全级的工业生产菌株，因为具有自然分泌大量的内源蛋白质到胞外的能力而被广泛应用，其内源性纤维素酶经发酵产量高达100g/l，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉因多样的翻译后修饰成为一种表达同源和异源蛋白质的理想重组蛋白表达宿主，并得到国际著名酶制剂公司(如genencor、novozymes等)高度重视，并成功应用于多种药物、化学试剂以及酶试剂的表达和生产。
2、里氏木霉产出的纤维素酶和半纤维素酶广泛被应用于各行业，如cbh1，cbh2，egl1，egl2，xyn1，xyn2和xyn3等。纤维素酶和半纤维素酶的启动子，具有诱导型和高表达量的特征，部分启动子，如cbh1和cbh2启动子，已被成功用于表达异源蛋白质。同时，里氏木霉的发酵工艺成熟，发酵成本较低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础。近年来，随着里氏木霉基因组学的快速发展以及其遗传操作系统的不断完善，利用里氏木霉表达异源蛋白也越来越受到重视。
3、索马甜(也译作嗦吗甜、莎马甜，thaumatin)，是从天然植物thaurnatococcusdaniellii的果实中提取出的超甜蛋白质，与其它植物来源具有类似特性的蛋白质如莫内林(monellin)、仙茅蛋白(库克灵，curcul
4、索马甜在食品加工、饲料和医药等领域都具有良好的应用前景，并展现出很高的商业价值。目前已报到的生产索马甜的技术主要从竹芋中进行提取，包括以下步骤：洗净、去核、打浆、离子交换、膜过滤、凝胶层析、醇沉、离心、过滤、调ph、降温和结晶等步骤。通过比较研究发现，已报道的方法步骤复杂，索马甜的甜度损失率高达55％以上，提取成本高，环境污染显著，并且对竹芋果实中的索马甜未能得到充分提取。因此通过基因工程改造技术，利用里氏木霉作为宿主表达重组索马甜ⅱ蛋白，对实现索马甜的工业化生产具有重要的实用价值和现实意义。
5、公开号为cn109170796a的专利提供一种从非洲竹芋中提取索马甜的方法，包括以下步骤：(1)将非洲竹芋鲜果洗净，去核，加水，打浆，过滤，离心，得离心清液；(2)将离心清液上阳离子交换树脂柱后，用洗脱剂洗脱，将洗脱液用纳滤膜纳滤，收集纳滤截留液；(3)将纳滤截留液上琼脂糖凝胶层析柱后，用洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩，冷却至室温，醇沉，离心，过滤，得索马甜粗品；(4)将索马甜粗品用温水溶解，冷却至室温，调节ph值至碱性，降温，搅拌析晶，离心，过滤，冰水洗晶，干燥，得索马甜精品。此专利技术注重如何提升从非洲竹芋中提取索马甜的总收率，但是并未给出关于利用基因重组技术生产索马甜的相关技术启示；在公开号为cn111574607a的专利中公开了一种基于微生物发酵从非洲竹芋中提取索马甜的方法，利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌在适宜的发酵环境下能合成降解纤维素和多糖的纤维素酶和淀粉酶来解除多糖类物质对索马甜提取的影响，使竹芋的核与果肉中含有的索马甜同时被提取，但是此专利技术只是在传统提取索马甜的方法上创新，本质上还是同样直接从非洲竹芋中提取索马甜。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株及其构建方法与应用，以qm6aδpyr4为宿主，将里氏木霉中纤维二糖水解酶基因(cbh1)替换为索马甜ⅱ(thaumatinⅱ)基因，通过基因工程在重组里氏木霉菌株中进行异源表达索马甜ⅱ蛋白。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的目的之一在于提供一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株，所述重组里氏木霉菌株命名为trichoderma reesei df230103，已于2023年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.41003。
4、进一步的，所述重组里氏木霉菌株采用同源重组技术将里氏木霉中纤维二糖水解酶基因cbh1替换为索马甜ⅱthaumatinⅱ基因，在重组里氏木霉菌株中进行索马甜ⅱ蛋白的异源表达。
5、本专利技术的目的之二在于提供一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组表达质粒，所述重组表达质粒ppcbh1-thaⅱ依次包含纤维素酶基因的启动子序列、索马甜ⅱ蛋白编码的基因序列、纤维素酶基因的终止子序列。
6、进一步的，其构建方法首先采用gibson连接的方式将索马甜ⅱ基因thaumatinⅱ片段与重组表达质粒载体ppcbh1-thaⅱ的片段进行连接；然后将连接产物转化大肠杆菌t1感受态，涂布固体板培养过夜后长出单菌落；最后设计引物vpcbh1-f与vthaⅱ-r进行菌落pcr，鉴定转化子，菌落pcr验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到所述重组表达载体ppcbh1-thaⅱ。
7、vpcbh1-f：gtgtggtaggatcgaacac
8、vthaⅱ-r：gtcgaaatagcagtcggtgc
9、进一步的，所述索马甜ⅱ基因thaumatinⅱ片段由genebank中登录号为aaa93095.1的索马甜ⅱthaumatinⅱ基因的核苷酸序列合成。
10、进一步的，所述重组表达质粒载体ppcbh1-thaⅱ的片段如下：
11、(1)设计引物gcbh1-u-f和gcbh1-u-r，以里氏木霉野生型菌株qm6a基因组为模板扩增pcbh1序列。
12、gcbh1-u-f：ctatagggagaccggcagcggccgcaaatctacacgtgggcccctttcg
13、gcbh1-u-r：gaagcaagtggtggcggccatgatgcgcagtccgcggttgac
14、(2)设计引物pyr4-f和pyr4-r，以里氏木霉野生型菌株qm6a基因组为模板扩增里氏木霉乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株，其特征在于，所述重组里氏木霉菌株命名为Trichoderma reesei DF230103，已于2023年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.41003。
2.如权利要求1所述的一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株，其特征在于，所述重组里氏木霉菌株采用同源重组技术将里氏木霉中纤维二糖水解酶基因cbh1替换为索马甜ⅡThaumatinⅡ基因，在重组里氏木霉菌株中进行索马甜Ⅱ蛋白的异源表达。
3.一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒pPcbh1-THAⅡ依次包含纤维素酶基因的启动子序列、索马甜Ⅱ蛋白编码的基因序列、纤维素酶基因的终止子序列。
4.如权利要求3所述的一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组表达质粒，其特征在于，其构建方法首先采用Gibson连接的方式将索马甜Ⅱ基因ThaumatinⅡ片段与重组表达质粒载体pPcbh1-THAⅡ的片段进行连接；然后将连接产物转化大肠杆菌T1感受态，涂布LB+Amp固体板培养过夜后长出单菌落；
5.如权利要求4所述的一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组表达质粒，其特征在于，所述索马甜Ⅱ基因ThaumatinⅡ片段由Genebank中登录号为AAA93095.1的索马甜ⅡThaumatinⅡ基因的核苷酸序列合成。
6.如权利要求4所述的一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒载体pPcbh1-THAⅡ的片段如下：
7.一种如权利要求1或2所述生产索马甜Ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株的构建方法，其特征在于，首先构建如权利要求3所述里氏木霉菌株的重组表达质粒pPcbh1-THAⅡ，然后将所述重组表达质粒转化至里氏木霉中，筛选获得表达索马甜Ⅱ蛋白的菌株。
8.如权利要求7所述的一种生产索马甜Ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.一种如权利要求7或8所述方法构建的生产索马甜Ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株在制备含有索马甜产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株，其特征在于，所述重组里氏木霉菌株命名为trichoderma reesei df230103，已于2023年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.41003。
2.如权利要求1所述的一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组里氏木霉菌株，其特征在于，所述重组里氏木霉菌株采用同源重组技术将里氏木霉中纤维二糖水解酶基因cbh1替换为索马甜ⅱthaumatinⅱ基因，在重组里氏木霉菌株中进行索马甜ⅱ蛋白的异源表达。
3.一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒ppcbh1-thaⅱ依次包含纤维素酶基因的启动子序列、索马甜ⅱ蛋白编码的基因序列、纤维素酶基因的终止子序列。
4.如权利要求3所述的一种生产索马甜ⅱ蛋白的重组表达质粒，其特征在于，其构建方法首先采用gibson连接的方式将索马甜ⅱ基因thaumatinⅱ片段与重组表达质粒载体ppcbh1-thaⅱ的片段进行连接；然后将连接产物转化大肠杆菌t1感受态，涂布lb+amp固体板培养过夜后长出单菌落；最后设计引...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨鑫，赵克东，
申请(专利权)人：福州道福生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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