【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，特别是涉及一种检测狮弓蛔虫的pcr试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
1、野生食肉动物携带各种线虫，包括各种人畜共患寄生虫，其能通过污染的水源、食物或直接接触感染人类。肠道蛔虫和钩虫感染等疾病均可从野生宿主传播给人类。人类感染各类蛔虫可导致隐性弓首蛔虫病、神经弓首蛔虫病(例如嗜酸性粒细胞性脑膜脑炎)、眼部幼虫移行症和内脏幼虫移行症，影响全球数百万儿童。从1983年到2019年，中国报告了103例人弓首蛔虫病例，主要发生在南方省份，儿童中的血清阳性率从1993年的12.14％上升到2015年的19.3％。此外，先前的研究在青海省反刍动物中发现了85种寄生虫感染，包括71种消化线虫(如toxaocara vitulorum)和13种肺线虫(如muellerius capillaris)，以及旋毛虫(trichinella spiralis)(一种寄生在横肌上的线虫)。在中国，黑龙江省记录了t.canis感染引起犬狼疮感染的病例。此外，另一项研究在中国四川省的11种野生动物中鉴定出三种蛔虫，包括犬弓首蛔虫(toxocara canis，t.canis)、猫弓首蛔虫(toxocara cati,t.cati)和狮弓蛔虫(toxascaris leonina，ta.leonina)。
2、ta.leonina属于线虫纲、蛔虫目，蛔虫科、弓蛔属，是一种多宿主寄生虫，除寄生于常见的犬科、猫科动物外，还可感染人类和多种动物，呈世界性分布。其虫卵约75μm，并覆有一层坚硬、光滑的外壳，宿主可经误食环境中的感染
3、各弓首蛔虫和弓蛔虫是人类弓蛔虫病的病原体，通常是由于意外摄入虫卵引起的。这种病症是全球最普遍的人畜共患蠕虫感染之一。然而，对这种人兽共患病的研究却被严重忽视了。在弓首属和弓蛔属中特异性鉴定蛔虫的常规方法多依赖于形态特征、宿主偏好和地理分布。然而，这些标准对密切相关或形态相似的蛔虫仍难以区分，尤其在幼虫和虫卵阶段。此外，上述蛔虫生活史的多样性可能会使虫体检测进一步复杂化。因此，开发一种更有效可靠的虫体鉴定方法对临床诊断和流行病学调查是极重要的。
4、对于寄生虫的检测，传统方法多为对虫卵的形态鉴定，包括显微镜观察、饱和盐水漂浮法和水洗沉淀法等。然而，这些方法无法区分种类相近的的虫体，如t.canis、t.cati和ta.leonina，只有通过利用分子方法才能实现这一目标。除此以外，上述方法多依赖于技术员的经验，以及虫卵的收集量，耗费时间长，工作量大，检出率较低。在人蛔虫病的诊断上，也开发出血清学的检测方法，但该方法在种属间存在交叉反应，且抗体的产生具有时间依赖性，因此无法实现早期诊断。
5、由于灵敏度和特异性，pcr方法已成为提高检测和鉴定肠道蛔虫的有力工具。目前，已经开发出用于检测和区分犬猫等动物的粪便样本及土壤样本中的t.canis和t.cati的几种pcr方法。这些基于dna的方法利用了its2等分子标记中存在的遗传多样性，使得t.canis和t.cati能够与相近虫体(如ta.leonina、t.vitulorum和t.malaysiensis)区分。然而，尽管取得了上述进展，但某些局限性阻碍了其对具有临床意义的弓蛔虫在粪便和土壤样本的常规筛查中的广泛使用。
6、目前，随着对犬猫蛔虫的分子生物学的发展，有研究称核糖体dna(rdna)中18s和28s亚基间的内转录间隔区1和2(its1、its2)两段序列，在同种内高度保守，但在种间有不同程度的变异。早期主要通过pcr和电泳显色条带多态性对不同弓蛔虫进行鉴定。有研究通过靶向弓蛔虫的its2序列设计引物，先经pcr扩增后测序并确定各扩增片段的限制性图谱，再选择hinfi和rsai限制性内切酶对各弓蛔虫its2扩增片段酶切，这种pcr-rflp法对不同弓首蛔虫、弓蛔虫间可以鉴定，具有一定特异性，但该法除对样本核酸处理外，还需要两步过程，相对耗时。此外，该研究同时设计了t.canis、t.cati、ta.leonina特异性的its2引物，以不同弓蛔虫的gdna为模板，分别用上述引物扩增，3对特异性引物均表现良好特异性，但该方法未涉及敏感性研究和定量检测。
7、有的研究通过靶向弓蛔虫的its2序列设计引物，pcr程序扩增后测序，利用非同位素sscp(cold-sscp)对不同种弓蛔虫的its2带型染色分析，结果表明，ta.leonina的its2比各对照弓首蛔虫种多一条主带，但t.canis和t.cati之间的带型无明显差异，无法鉴别。
8、目前，用于鉴定t.canis和t.cati的双taqman探针qpcr检测方法已经被报道，但是ta.leonina的检测仍处于基本定性阶段。基于上述问题，本申请提出了基于ta.leonina的its2基因序列设计特异性引物的taqman pcr方法来检测这种犬猫中的常见弓蛔虫。具有快速、灵敏、特异、经济的优点，提高了阳性检出率，还可以实现对ta.leonina的早期检测，同时从原有的定性阶段发展为定量阶段。
技术实现思路
1、本专利技术主要解决的技术问题是提供一种检测狮弓蛔虫的pcr试剂盒及其检测方法和应用，本专利技术的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好，检测限低的特点。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种检测狮弓蛔虫的pcr试剂盒，所述试剂盒包括用于检测狮弓蛔虫的正向引物、反向引物和探针，其中，所述正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，探针的序列如seqid no.3所示。
3、进一步地，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照为重组质粒。
4、进一步地，所述重组质粒的序列如seq id no.4所示。
5、进一步地，所述试剂盒还包括premix taq和ddh2o。
6、本专利技术公开了一种检测狮弓蛔虫的pcr反应体系，所述反应体系包括0.2μl浓度为10μm的正向引物、0.2μl浓度为10μm的反向引物、0.2μl浓度为20μm的探针、5μl dna模板以及4.4μl上述的dd h2o和10μl上述的premix taq；其中，所述正向引物的序列如seq idno.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，探针的序列如seq id no.3所示。
7、本专利技术公开了上述试剂盒的检测方法，具体步骤如下：
8、s1：采集并提取样品的dna；
9、s2：配制上述的反应体系，作为待测样本；
10、s3：进行荧光定量pcr反应。
11、进一步地，所述s3中pcr反应包括95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火延伸31s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测狮弓蛔虫的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测狮弓蛔虫的正向引物、反向引物和探针，其中，所述正向引物的序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照为重组质粒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述重组质粒的序列如SEQ IDNO.4所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Premix Taq和ddH2O。
5.一种检测狮弓蛔虫的PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系包括0.2μL浓度为10μM的正向引物、0.2μL浓度为10μM的反向引物、0.2μL浓度为20μM的探针、5μL DNA模板以及4.4μL如权利要求4所述的dd H2O和10μL如权利要求4所述的Premix Taq；其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，探针的序列如SEQ IDNO.3所示。
...【技术特征摘要】
1.一种检测狮弓蛔虫的pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测狮弓蛔虫的正向引物、反向引物和探针，其中，所述正向引物的序列如seq idno.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，探针的序列如seq id no.3所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照为重组质粒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述重组质粒的序列如seq idno.4所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括premix taq和ddh2o。
5.一种检测狮弓蛔虫的pcr反应体系，其特征在于，所述反应体系包括0.2μl浓度为10μm的...
【专利技术属性】
技术研发人员：芭菈蒂，王昱，鲍枳月，杨玲焰，时长军，
申请(专利权)人：苏州西山生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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