【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，具体涉及微生物发酵生物转化制备食品级光学纯d-苯乳酸或l-苯乳酸的一种方法，属于食品生物。
技术介绍
1、苯乳酸(phenyllactic acid，pla)，其别名为3-苯基乳酸或β-苯乳酸，相对分子质量为166.17，是一种小分子的手性化合物，有d-苯乳酸(d-pla)和l-苯乳酸(l-pla)两种对映异构体。
2、苯乳酸是近年来发现的一种新型天然防腐剂，可破坏细菌和真菌的细胞膜，有较广的抑菌谱，能抑制食源性致病菌、腐败菌，特别是它能抑制真菌的污染可延长食品的货架期；溶解性好、易于在各种食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的ph范围和热稳定性；这些优点使其在食品工业中的应用有广阔的前景。
3、目前，苯乳酸的合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成主要有锌汞齐还原法、苯丙酮酸催化氢化法、不对称环氧化合物及sn2反应等方法。化学合成法虽然稳定可靠，但是其操作复杂、耗能较高，对环境污染严重，限制了其在食品工业中的应用。采用生物合成法，具有反应条件温和、底物易获取、环境友好等优势，工业化应用前景好。
4、在采用生物合成苯乳酸的过程中，现阶段所报道的合成底物一般以苯丙氨酸和苯丙酮酸为主，其中苯丙氨酸的合成效率较低，而苯丙酮酸虽然转化率稍高，但是价格较贵，且理化性质不稳定。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术目的是提供一种四酶级联生物催化制备食品级光学纯苯乳酸的方法，具体技术方案如
2、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于通过构建四酶重组工程菌株，将苏氨酸醛缩酶(psta)、苏氨酸脱水酶(pxpsdh)、乳酸脱氢酶(laldh)和甲酸脱氢酶(fdh)在大肠杆菌中共表达，通过生物级联催化，实现以苯甲醛、甘氨酸和甲酸钠为原料合成光学纯的d-苯乳酸或l-苯乳酸。
3、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于构建四酶重组工程菌株时，甲酸脱氢酶可替换为葡萄糖脱氢酶(gdh)，将苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中共表达，通过生物级联催化，实现以苯甲醛、甘氨酸和葡萄糖为原料合成光学纯的d-苯乳酸或l-苯乳酸。
4、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于四酶重组工程菌株的构建方法包括以下步骤：
5、1)双酶重组工程菌的构建：将苏氨酸醛缩酶和苏氨酸脱水酶通过酶切连接构建在同一载体上，转化至大肠杆菌中，得到苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶重组质粒；将乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过酶切连接构建在同一载体上，转化至大肠杆菌中，得到乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶重组质粒；将乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶通过酶切连接构建在同一载体上，转化至大肠杆菌中，得到乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶重组质粒；以上所述载体为prsfduet、pcdfduet、pacycduet或petduet。
6、2)四酶重组工程菌的构建：制备苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶大肠杆菌感受态细胞，将乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶重组质粒或乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶重组质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达，得到苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶共表达的重组工程菌或苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶共表达的重组工程菌。
7、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于苏氨酸醛缩酶的酶切位点为nco i和bamh i，所述苏氨酸脱水酶的酶切位点为nde i和xho i，所述乳酸脱氢酶的酶切位点为nde i和xho i，所述甲酸脱氢酶的酶切位点为nco i和bamh i，所述葡萄糖脱氢酶的酶切位点为ncoⅰ和hindⅲ。
8、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于乳酸脱氢酶为以下四种中的一种：d-乳酸脱氢酶d-laldh、d-乳酸脱氢酶d-ldldh、l-乳酸脱氢酶l-bcldh和l-乳酸脱氢酶l-lpldh。
9、所述苏氨酸醛缩酶psta的核苷酸序列为序列表中seq id no.1；所述苏氨酸脱水酶pxpsdh的核苷酸序列为序列表中seq id no.2；所述d-乳酸脱氢酶d-laldh的核苷酸序列为序列表中seq id no.3；所述d-乳酸脱氢酶d-ldldh(y52l)的核苷酸序列为序列表中seqid no.4；所述l-乳酸脱氢酶l-bcldh的核苷酸序列为序列表中seq id no.5；所述l-乳酸脱氢酶l-lpldh的核苷酸序列为序列表中seq id no.6；所述甲酸脱氢酶fdh的核苷酸序列为序列表中seq id no.7；所述葡萄糖脱氢酶gdh的核苷酸序列为序列表中seq id no.8。
10、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于以构建的四酶重组工程菌为载体，以苯甲醛、甘氨酸和甲酸钠为底物或以苯甲醛、甘氨酸和葡萄糖为底物，以5′-磷酸吡哆醛为辅助因子进行催化反应；苏氨酸醛缩酶能够以苯甲醛和甘氨酸为底物，生物合成β-苯丝氨酸；苏氨酸脱水酶可催化β-苯丝氨酸氨酸脱氨以产生苯丙酮酸和氨；以生成的苯丙酮酸、甲酸钠(或葡萄糖)为底物，在乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶(或葡萄糖脱氢酶)作用下，最终得到食品级光学纯d-苯乳酸或l-苯乳酸。
11、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于以苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-l-乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶为全细胞载体进行生物催化反应时，在100mm tris-hcl，ph6.5-8.5的反应体系中，加入10-50g/l菌体，50mm苯甲醛，500mm甘氨酸，50-400mm甲酸钠，0.5mm 5′-磷酸吡哆醛，在20-37℃下反应12h，生物催化产物为食品级光学纯l-苯乳酸。
12、优选地，在反应体系中，ph为8.0；和/或菌体的浓度为50g/l；和/或苯甲醛与甲酸钠的物质的量浓度比例为1:2-1:4；和/或反应温度为25℃。
13、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于以苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-d-乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶为全细胞载体进行生物催化反应时，在100mm tris-hcl，ph6.5-8.5的反应体系中，加入10-50g/l菌体，50mm苯甲醛，500mm甘氨酸，50-400mm甲酸钠，0.5mm 5′-磷酸吡哆醛，在20-37℃下反应12h；生物催化产物为食品级光学纯d-苯乳酸。
14、优选地，在反应体系中，ph为7.5；和/或菌体的浓度为50g/l；和/或苯甲醛与甲酸钠的物质的量浓度比例为1:4；和/或反应温度为30℃。
15、所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于以苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-l-乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶为全细胞载体进行生物催化反应时，在100mm tris-hcl，ph 6.5-8.5的反应体系中，加入10-50g/l菌体，50mm苯甲醛，500mm甘氨酸，50-400mm葡萄糖，0.5mm 5′-磷酸吡哆醛，在20-37℃下反应12h，生物催化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，构建四酶重组工程菌株，将苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在大肠杆菌中共表达，通过生物级联催化，实现以苯甲醛、甘氨酸和甲酸钠为原料合成光学纯的D-苯乳酸或L-苯乳酸。
2.根据权利要求1所述的一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，构建四酶重组工程菌株时，甲酸脱氢酶可替换为葡萄糖脱氢酶，将苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中共表达，通过生物级联催化，实现以苯甲醛、甘氨酸和葡萄糖为原料合成光学纯的D-苯乳酸或L-苯乳酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，所述四酶重组工程菌株的构建方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述苏氨酸醛缩酶的酶切位点为Nco I和BamH I，所述苏氨酸脱水酶的酶切位点为Nde I和Xho I，所述乳酸脱氢酶的酶切位点为NdeI和Xho I，所述甲酸脱氢酶的酶切位点为Nco I和BamH I，所述葡萄糖脱氢酶的酶切位点为NcoⅠ和Hind
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述乳酸脱氢酶为以下四种中的一种：D-乳酸脱氢酶D-LaLDH、D-乳酸脱氢酶D-LdLDH、L-乳酸脱氢酶L-BcLDH和L-乳酸脱氢酶L-LpLDH。
6.根据权利要求3所述的四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，以所述四酶重组工程菌为载体，以苯甲醛、甘氨酸和甲酸钠为底物，以5′-磷酸吡哆醛为辅助因子进行生物催化反应，得到食品级光学纯的D-苯乳酸或L-苯乳酸。
7.根据权利要求3所述的四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，以所述四酶重组工程菌为载体，以苯甲醛、甘氨酸和葡萄糖为底物，以5′-磷酸吡哆醛为辅助因子进行生物催化反应，得到食品级光学纯的D-苯乳酸或L-苯乳酸。
8.根据权利要求6所述的四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，当合成所述食品级光学纯的D-苯乳酸时，以苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-D-乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶为全细胞催化载体，在100mM Tris-HCl，pH 6.5-8.5的反应体系中，加入10-50g/L菌体，50mM苯甲醛，500mM甘氨酸，50-400mM甲酸钠，0.5mM 5′-磷酸吡哆醛，在20-37℃下反应12h；在反应体系中，pH为8.0；菌体的浓度为50g/L；苯甲醛与甲酸钠的物质的量浓度比例为1:2-1:4；反应温度为25℃。
9.根据权利要求6所述的四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，当所述合成的食品级苯乳酸为食品级L-苯乳酸时，以苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-L-乳酸脱氢酶-甲酸脱氢酶为全细胞催化剂，在100mM Tris-HCl，pH 6.5-8.5的反应体系中，加入10-50g/L菌体，50mM苯甲醛，500mM甘氨酸，50-400mM甲酸钠，0.5mM 5′-磷酸吡哆醛，在20-37℃下反应12h；在反应体系中，pH为7.5；菌体的浓度为50g/L；苯甲醛与甲酸钠的物质的量浓度比例为1:4；反应温度为30℃。
10.根据权利要求7所述四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，当合成的所述食品级苯乳酸为食品级D/L-苯乳酸时，以苏氨酸醛缩酶-苏氨酸脱水酶-D/L-乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶为全细胞催化剂，在100mM Tris-HCl，pH 6.5-8.5的反应体系中，加入10-50g/L菌体，50mM苯甲醛，500mM甘氨酸，50-400mM葡萄糖，0.5mM 5′-磷酸吡哆醛，在20-37℃下反应12h；在反应体系中，pH为7.5；菌体的浓度为50g/L；苯甲醛与葡萄糖的物质的量浓度比例为1:4；反应温度为30℃。
...【技术特征摘要】
1.一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，构建四酶重组工程菌株，将苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在大肠杆菌中共表达，通过生物级联催化，实现以苯甲醛、甘氨酸和甲酸钠为原料合成光学纯的d-苯乳酸或l-苯乳酸。
2.根据权利要求1所述的一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，构建四酶重组工程菌株时，甲酸脱氢酶可替换为葡萄糖脱氢酶，将苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中共表达，通过生物级联催化，实现以苯甲醛、甘氨酸和葡萄糖为原料合成光学纯的d-苯乳酸或l-苯乳酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的一种四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，所述四酶重组工程菌株的构建方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述苏氨酸醛缩酶的酶切位点为nco i和bamh i，所述苏氨酸脱水酶的酶切位点为nde i和xho i，所述乳酸脱氢酶的酶切位点为ndei和xho i，所述甲酸脱氢酶的酶切位点为nco i和bamh i，所述葡萄糖脱氢酶的酶切位点为ncoⅰ和hindⅲ。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述乳酸脱氢酶为以下四种中的一种：d-乳酸脱氢酶d-laldh、d-乳酸脱氢酶d-ldldh、l-乳酸脱氢酶l-bcldh和l-乳酸脱氢酶l-lpldh。
6.根据权利要求3所述的四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，以所述四酶重组工程菌为载体，以苯甲醛、甘氨酸和甲酸钠为底物，以5′-磷酸吡哆醛为辅助因子进行生物催化反应，得到食品级光学纯的d-苯乳酸或l-苯乳酸。
7.根据权利要求3所述的四酶级联生物催化制备苯乳酸的方法，其特征在于，以所述四酶重组工程菌为载体，以苯甲醛、甘氨酸和葡萄糖为底物，以5′-磷酸吡哆醛为辅助因子进行生物催化反...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈启佳，程爽爽，张思思，张晓赫，赵丹丹，贾振华，郝建雄，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：
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