【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞生物学领域，特别是一种多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法及试剂盒。
技术介绍
1、越来越多的研究发现，免疫调控对于神经发育过程具有重要的调节作用。神经免疫微环境是一个动态变化的异质性系统，在时空分布、功能表型和代谢特征方面存在巨大差异。但中枢神经系统的免疫微环境有其特殊性，固有的免疫细胞是早期发育来的小胶质细胞，约占大脑细胞总数的5％-10％。小胶质细胞作为中枢神经系统发育、体内稳态平衡和神经疾病的重要参与者，在生理状态和病理状态下均发挥重要功能。在中枢神经系统发育过程中，小胶质细胞“见证”并参与了许多重要过程，如细胞程序性死亡、重塑神经网络、调节神经元层状定位、融合内皮细胞增加脉管网络复杂性等。多项在小鼠模型中的研究发现，神经干细胞的定向分化与神经重塑潜能会受到免疫微环境稳态的影响。小胶质细胞功能受损与神经发育(即孤独症或精神分裂症)和神经退行性(即阿尔茨海默病，ad)障碍之间存在关键联系。因此，为了研究这些疾病背景下的人类小胶质细胞的功能，有必要开发一种在人脑中复制功能性小胶质细胞的模型系统。
2、大脑类脑体通过允许在3d中从多能干细胞分化和自组织发育神经组织，脑类脑体模型能够以传统方法无法实现的方式访问人类疾病模型和表型。由于小胶质细胞起源于中胚层谱系细胞，因此在类脑体分化方案中通常不存在小胶质细胞。为了模拟复杂的神经-小胶质细胞相互作用，已有研究将分化的小胶质细胞植入脑类脑体。虽然这些研究已经有效地证明外源性小胶质细胞可以整合，产生免疫应答，并参与类脑体内的神经元群体的功能性串扰，但在
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法及试剂盒，相对于现有技术而言，方法更加简单，小胶质细胞可浸润至类脑体内部。
2、本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：
3、本专利技术提供了一种多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，包括以下步骤：
4、(1)采用多能干细胞依次利用培养基i、培养基ii、培养基iii及培养基viii诱导分化cd43+小胶质细胞前体细胞；
5、(2)采用多能干细胞依次利用培养基iv、培养基v、培养基vi及培养基vii诱导分化类脑体；
6、(3)将步骤(1)与步骤(2)中分别获得的cd43+小胶质细胞前体细胞及类脑体依次利用培养基viii、培养基ix及培养基x共培养，得到含有小胶质细胞的神经免疫类脑体；
7、其中，所述培养基i、培养基ii及培养基iii通过在pgm1培养基的基础上分别添加多种试剂制备得到；
8、所述培养基iv、培养基v及培养基vi通过在dmem/f-12的基础上分别添加多种试剂制备得到；
9、所述培养基vii、培养基viii、培养基ix及培养基x通过在neurobasal a培养基的基础上分别添加多种试剂制备得到。
10、进一步的，在步骤(1)中，所述诱导分化的具体步骤如下：
11、(1-1)将人多能干细胞培养在matrigel包被过的六孔板上，pgm1培养基，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养至细胞贴壁生长至70％，期间每天更换一次培养基，每次2-4ml；
12、(1-2)吸出上层液并用dpbs冲洗六孔板后，每孔加入0.5ml accutase细胞消化液，37℃，5％co2的加湿培养箱静置3分钟，加入1ml pgm1培养基稀释消化，300g离心5分钟收集细胞；
13、(1-3)吸出上层液并用pgm1培养基重悬，按50000细胞/cm2将细胞接种在新的六孔板中，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养1天，轻轻拍打收集拟胚体；
14、(1-4)将步骤(1-3)收集的拟胚体用培养基i重悬，接种在新的六孔板中，37℃，5％co2，5％o2的加湿培养箱中培养2天，收集拟胚体；
15、(1-5)将步骤(1-4)收集的拟胚体用培养基ii重悬，37℃，5％co2，5％o2的加湿培养箱中培养2天，收集拟胚体；
16、(1-6)将步骤(1-5)收集的拟胚体用培养基iii重悬，置于37℃，5％co2的加湿培养箱中培养12天，每天每个孔补充1ml培养基，收集上层细胞；
17、(1-7)将步骤(1-6)收集的上层细胞用培养基viii重悬，利用70μm筛网过滤大的细胞团块，按1∶100加入apc-cd43抗体，4℃避光孵育1个小时，200g离心5分钟收集细胞，用facs缓冲液洗涤一次，最后用500-700μl facs缓冲液重悬，重悬细胞通过流式细胞仪分选cd43+小胶质细胞前体细胞，利用培养基viii收集即得诱导分化后的cd43+小胶质细胞前体细胞；
18、进一步的，在步骤(2)中，所述诱导分化的具体步骤如下：
19、(2-1)将人多能干细胞培养在matrigel包被过的六孔板上，采用pgm1培养基，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养至细胞贴壁生长至70％，期间每天更换一次培养基，每次2-4ml；
20、(2-2)吸出上层液并用dpbs冲洗六孔板后，每孔加入0.5ml accutase细胞消化液，37℃，5％co2的加湿培养箱静置3分钟，加入1ml pgm1培养基稀释消化，300g离心5分钟收集细胞；
21、(2-3)吸出上层液并用培养基iv重悬，按9000细胞/孔，将细胞接种在低吸附96孔板中，300rpm，离心5min，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养2天，收集拟胚体；
22、(2-4)吸出75μl上层液并缓慢加入培养基v，150μl/孔，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养2天，收集拟胚体；
23、(2-5)吸出150μl上层液并缓慢加入培养基vi，150μl孔，37℃，5％co2的加湿培养箱中培养2天，收集拟胚体；
24、(2-6)吸出上层培养基，加入150μl培养基vii，每天更换新鲜150μl培养基vii，培养12天，收集类脑体。
25、进一步的，在步骤(3)中，所述共培养的具体步骤如下：
26、(3-1)将类脑体更换150μl培养基viii；
27、(3-2)收集流式分选的cd43+小胶质细胞前体细胞，计数，按1.5*106细胞/孔，将cd43+小胶质细胞前体细胞加入96孔板的类脑体中，补充培养基viii至225μl/孔，培养7天，隔天换液。
28、(3-3)吸出上层培养基，加入225μl培养基ix，隔天更换新鲜225μl培养基ix，培养18天，收集3d类脑体；
29、(3-4)吸出上层培养基，加入225μl培养基x，隔天更换新鲜2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述诱导分化的具体步骤如下：
3.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述诱导分化的具体步骤如下：
4.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述共培养的具体步骤如下：
5.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，所述培养基I、培养基II及培养基III的具体制备方法为：
6.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，所述培养基IV、培养基V及培养基VI的具体制备方法为：
7.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，所述培养基VII、培养基VIII、培养基IX及培养基X的具体制备方法为：
8.一种利用多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的试剂盒，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述诱导分化的具体步骤如下：
3.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述诱导分化的具体步骤如下：
4.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述共培养的具体步骤如下：
5.如权利要求1所述的多能干细胞诱导产生神经免疫类脑体的方法，其特征在于，所述培养基i、培养基i...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘长梅，徐雅洁，滕兆乾，李骞，刘佩佩，杜洪震，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。