【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环境微生物及生态学领域，特别涉及一种扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用。
技术介绍
1、硝化作用即氨通过亚硝酸盐氧化成硝酸盐，是生物地球化学氮循环的重要过程，在生物废水处理和农业生产的氮肥流失控制中起着重要作用。硝化作用一直被认为是由分别氧化氨和亚硝酸盐的微生物协同完成的。完全氨氧化菌(comammox)是一类新发现的能直接将氨氧化成硝酸盐的微生物，为应对这一发现需要开发新的方法来检测和量化comammox，以评估它们对硝化作用的贡献及与其它硝化微生物之间的功能关系。
2、目前已发现的comammox在分类上都归属于亚硝酸盐氧化细菌的nitrospira属且不形成单系分支，因此传统的基于16s rrna基因序列的系统发育分析无法区分完全氨氧化菌与亚硝酸盐氧化细菌。氨单加氧酶(amo)是完全氨氧化菌执行硝化过程的关键酶，编码amo亚基a(amoa)的基因是氨氧化细菌和古细菌研究中广泛使用的功能和系统发育标记基因。comammox的amoa基因序列具有一定的保守性，全长在900bp左右，且在基因组中通常只有1-2个拷贝，因此基于amoa基因的序列可以分析comammox的多样性，基于amoa基因数量可以间接反应comammox的数量。针对amoa基因设计特异性引物可以用于对comammox的定性、定量检测及高通量测序的多样性分析。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种扩增完全氨氧化菌comammox
2、本专利技术的另一目的在于，提供上述引物在完全氨氧化菌comammox的检测、定量及扩增子高通量测序分析中的应用。
3、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、一种扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物，为如下引物对中的至少一种：
5、f1：gactgggatttctggntngaytgg；
6、f2：tatmggcagccattyggngcrac；
7、r1：acctcgatcatccggatrtaytcngg；
8、r2：gamgaactkcccrawytgccacca；
9、以上引物两两组合配对，所得到的引物对f1/r1、f1/r2、f2/r1、f2/r2。
10、所述的扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物为简并引物。
11、所述的扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物扩增得到的特异性条带长度为359～576bp；优选的，引物对f1/r1扩增得到的特异性条带长度为467bp，引物对f1/r2扩增得到的特异性条带长度为576bp，引物对f2/r1扩增得到的特异性条带长度为359bp，引物对f2/r2扩增得到的特异性条带长度为465bp。
12、所述的扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物，其核苷酸序列含有简并碱基，其中n指的是该位置的碱基为等比例的a、g、c和t，y指的是该位置的碱基为等比例的c和t，r指的是该位置的碱基为等比例的a和g，m指的是该位置的碱基为等比例的a和c，k指的是该位置的碱基为等比例的g和t，w指的是该位置的碱基为等比例的a和t。
13、上述扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物在完全氨氧化菌comammox的检测、定量及扩增子高通量测序分析中的应用。
14、上述的应用能够同时涵盖完全氨氧化菌comammox的cladea和cladeb两个进化分支。
15、一种检测完全氨氧化菌comammox的方法，包括如下步骤：
16、(1)提取待测样本的基因组dna；
17、(2)使用扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组dna进行pcr扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出对应条带，则证明样本中含有完全氨氧化菌comammox。
18、一种对完全氨氧化菌comammox定量的方法，包括如下步骤：
19、(1)提取待测样本的基因组dna；
20、(2)使用扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组dna进行pcr扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收扩增产物，构建质粒并克隆表达，提取该质粒测定核酸浓度并计算拷贝数浓度，然后进行梯度稀释；
21、(3)使用扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物对质粒进行荧光定量pcr扩增，建立质粒标准品拷贝数浓度与达到荧光域值时的循环数ct值之间的标准曲线；
22、(4)使用扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组dna进行荧光定量pcr扩增，将结果代入上述标准曲线中，获得样本中完全氨氧化菌的数量。
23、一种通过高通量测序对完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因扩增子的多样性进行分析的方法，包括如下步骤：
24、(1)提取待测样本的基因组dna；
25、(2)使用扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物对样本的基因组dna进行pcr扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收，得到扩增产物；
26、(3)对扩增产物进行高通量测序，并根据测序结果进行多样性分析。
27、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
28、本专利技术提供了一种扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物及其应用，该引物能同时扩增cladea和cladeb分支的amoa基因，在应用中极大简化操作步骤；与其它能同时扩增两个分支的引物相比本专利技术提供的引物表现出更好的扩增效果，在应用中能获得更准确的检测结果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种扩增完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因的引物，其特征在于为如下引物对中的至少一种：
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
5.权利要求1～4任一所述的引物在完全氨氧化菌Comammox的检测和/或定量中的应用。
6.权利要求1～4任一所述的引物在完全氨氧化菌Comammox的扩增子高通量测序分析中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：
8.一种检测完全氨氧化菌Comammox的方法，其特征在于包括如下步骤：
9.一种对完全氨氧化菌Comammox定量的方法，其特征在于包括如下步骤：
10.一种通过高通量测序对完全氨氧化菌Comammox氨单加氧酶基因扩增子的多样性进行分析的方法，其特征在于包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种扩增完全氨氧化菌comammox氨单加氧酶基因的引物，其特征在于为如下引物对中的至少一种：
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
5.权利要求1～4任一所述的引物在完全氨氧化菌comammox的检测和/或定量中的应用。
6.权利要求1～4任一所述的引物在完全氨氧...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。