一种基于双抗体识别的血清中ＭＧ７－Ａｇ的定量检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及血清中ＭＧ７－Ａｇ的检测方法，通过双抗体对ＭＧ７－Ａｇ的识别、捕捉，在抗原信号转换的基础上结合实时荧光定量免疫ＰＣＲ检测方法来实现精确定量检测血清中痕量抗原ＭＧ７－Ａｇ含量。将实时荧光定量ＰＣＲ技术与特异性的抗原抗体反应系统相结合，建立实时荧光定量免疫ＰＣＲ技术。此项技术通过双抗体特异性的识别血清中ＭＧ７－Ａｇ，然后用链亲和素分别结合生物素化ＭＧ７和生物素化的ＤＮＡ，将血清中的ＭＧ７－Ａｇ含量的信号转化为核酸信号后，进入实时荧光定量ＰＣＲ扩展途径，从而精确检测血清中痕量抗原ＭＧ７－Ａｇ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及血清中MG7-Ag的检测方法，特别涉及一种基于双 抗体识别的血清中MG7-Ag的定量检测方法。
技术介绍
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。恶性肿瘤的研究及应用方向已从以治疗为主转向防治结合。肿瘤的早期诊断尤为重要，它决定了肿瘤治疗的成败。胃癌是我国常见重大恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均在继续上升。目前用于胃癌早期筛查最可靠的途径是内窥镜检查结合活体组织病理检查。但是，对于少数夹杂在正常组织细胞中的形态不典型胃癌细胞、分化差或未分化的胃癌细胞、发生淋巴结转移的胃癌肿瘤鉴别难度很大；而肿瘤标志物的检查是一种很有效的方法。 肿瘤标志物(Cancer biomarker)的发现和应用是一个系统的方法，从高危人群的筛查、早期癌症的检出，到诊断及定位、机体对治疗的反应及预后观察，直至癌症复发的检测，肿瘤标志物发挥了重要的作用。目前临床常用的胃癌的肿瘤标志物有CEA、 CA19-9、CA72-4等，受CEA、 CA19-9和CA72-4标志物特异性的限制，能够检测到以上标志物的绝大多数患者，其病情已进入中晚期。 樊代明等人最新发现了一种胃癌特异性抗原MG7-Ag(Lee CH， Lum JH， Fan DM et al. Proteomics. 2005 ;5 (4) :1160-1166)，并针对该抗原制备了鼠源性单克隆抗体MG7 (Fan DM， Zhang XY， Chen XT et al. Journal of Gastroener-ology and H印atology. 2005 ; 20(3) :360-365)。在组织学研究中发现，MG7_Ag在胃癌中阳性率达90 %以上，在正常胃 粘膜中不表达。MG7-Ag表达量在萎縮性胃炎、异型增生及胃癌组织中呈渐进递增，同时对 MG7-Ag阳性的萎縮性胃炎及异型增生患者随访，其转癌率显著增高(Liu J，Hu几，Fan匿 et al. Int J Clin Pract. 2002 ;56 (3) :169-172)。国家973项目(G1998051203)通过严格 "双盲"前瞻回顾性研究证实，胃粘膜上皮肠化生、异型增生呈MG7-Ag阳性表达者与阴性表 达者相比较，病变进展危险性增加25 40多倍，提示MG7-Ag与胃癌发生发展和分化有良 好的相关性，对于检测胃癌的高危个体有重要的应用价值。 现有对于MG7-Ag的定量检测主要是通过酶联免疫(ELISA)方法，其中包括包被抗 原、抗原抗体反应、二抗反应、显色、读板等步骤。由于血清中MG7-Ag属于微量抗原，含量很 小，酶联免疫测定方法敏感度仅达ng水平，精度不高，容易出现误差，无法实现准确定量。 实时荧光定量PCR技术出现于1996年，该技术的核心是在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别；而后荧光的产生进入 指数扩增期，荧光水平随之呈指数增长；最后在PCR到达平台期时荧光水平达到饱和，且由 于PCR技术是指数扩大系统，微小误差的指数放大使终产物量存在较大的离散度。而实时 荧光定量PCR技术有效地解决了传统PCR只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测 一次荧光信号的强度。设定检测点荧光值在指数扩增阶段为荧光阈值，当荧光信号强度到3达所设定的荧光阈值时，自动记录荧光信号达到荧光阈值所经历的循环数(Ct值)。 已经证实，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷 贝数越多，Ct值越小。因此利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线对未知样本进行 定量测定。由于PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时 微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管 内扩增，得到Ct值是恒定的。基于以上两大特点，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲 线定量的方法。 由于传统定量方法都是PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过指数期扩增到达 平台期时，检测重现性极差，无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标可部分消 除终产物定量所造成的不准确性。但在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反 应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始 拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。由于待测样品的起始拷贝数是未知的， 所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内 标，但仍然只是一种半定量、粗略定量的方法。外标法定量和内标法定量的方法学比较后的 结论是内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准 确的、值得信赖的科学方法。 随着实时荧光定量PCR技术的不断推广和普及，该技术已被广泛应用于基础科学 研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等重要领域。主要集中在以下几个方面1、DNA或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi基因失活率的检测等。2、基因表达差异分析，例如比较经过不同处理样本之间特定基 因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以 及cDNA芯片或差异显示结果的确证。3、基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。但是，实 时荧光定量PCR技术仅限于核酸定量。 申请号为200910021300. 7的中国专利技术专利公开了一种血清中MG7-Ag抗原的检测 方法，该方法是基于抗原抗体反应捕捉血清中的MG7-Ag，然后再通过链亲和素将生物素化 DNA与生物素化二抗结合，将蛋白信号转化成核酸信号，然后进行Real-time PCR扩增放大 信号，通过实时荧光定量免疫PCR定量血清中胃癌相关抗原MG7Ag。但是，上述方法仍存在 一定的缺陷，抗原抗体反应捕捉血清中的MG7-Ag时血清中大量的非特异性物质会影响胃 癌肿瘤相关抗原包被效率；在此基础上经过多次的信号转换并最后经PCR放大，每一环节 都会直接影响方法的特异性和稳定性。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供，提 高血清中的痕量的与胃癌相关的MG7-Ag定量检测的特异性和准确性。 本专利技术通过以下技术方案实现 1)包被用包被缓冲液将单克隆抗体MGb2浓度稀释至10ii g/ml，然后加入到 realtime-PCR反应管中，每个反应管加入50 iU， 37。C孵育lh后用PBS-T液洗涤； 2)封闭每个反应管加入5mg/ml BSA作为封闭液，37。C孵育lh后用PBS-T液洗 涤；4 3)抗原抗体反应封闭完成后，相应的反应管中加入50ml的标准品或检测样品， 4"C过夜，弃去液体，然后用PBS-T液洗涤； 所述的标准品为梯度浓度稀释的MG7-Ag标准品；所述的检测样品为待测血清； 4)生物素化的MG7抗体结合抗原抗体反应完成后，每个反应管加入50ml生物素 化的MG7抗体，37t:孵育lh后用PBS-T液洗涤； 5)链亲和素结合生物素化的MG7抗体结合完成后，每个反应管加入50ml的链亲 和素，37。C孵育本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双抗体识别的血清中ＭＧ７－Ａｇ的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：１）包被：用包被缓冲液将单克隆抗体ＭＧｂ２浓度稀释至１０μｇ／ｍｌ，然后加入到ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＰＣＲ反应管中，每个反应管加入５０μｌ，３７℃孵育１ｈ后用ＰＢＳ－Ｔ液洗涤；２）封闭：每个反应管加入５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ作为封闭液，３７℃孵育１ｈ后用ＰＢＳ－Ｔ液洗涤；３）抗原抗体反应：封闭完成后，相应的反应管中加入５０μｌ的标准品或检测样品，４℃过夜，弃去液体，然后用ＰＢＳ－Ｔ液洗涤；所述的标准品为梯度浓度稀释的ＭＧ７－Ａｇ标准品；所述的检测样品为待测血清；４）生物素化的ＭＧ７抗体结合：抗原抗体反应完成后，每个反应管加入５０μｌ生物素化的ＭＧ７抗体，３７℃孵育１ｈ后用ＰＢＳ－Ｔ液洗涤；５）链亲和素结合：生物素化的ＭＧ７抗体结合完成后，每个反应管加入５０μｌ的链亲和素，３７℃孵育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ－Ｔ液洗涤；６）生物素化的ＤＮＡ报告分子结合：链亲和素结合完成后，每个反应管加入５０μｌ的生物素化ＤＮＡ，３７℃孵育３０ｍｉｎ后用ＰＢＳ－Ｔ液洗涤；７）实时荧光定量ＰＣＲ反应：以洗涤完成后每个反应管所得生物素化ＤＮＡ为模板分别进行实时荧光定量ＰＣＲ反应；ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性４５ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ；３５～４０个循环结束后于７２℃延伸１０分钟；以ＰＣＲ扩增生物素化ＤＮＡ的延伸温度７２℃处读取荧光检测量，得到每孔对应的ＰＣＲ扩增曲线；８）绘制标准曲线：根据标准品管对应的一组ＰＣＲ扩增曲线，设定荧光检测阈值，得到该荧光检测阈值处的对应标准品管的一组循环数；根据每个标准品管的标准品浓度和其达到荧光检测阈值的循环数的对应关系，建立标准曲线；９）确定检测样品的循环数：根据检测样品管对应的一组ＰＣＲ扩增曲线，得到每孔检测样品达到荧光检测阈值处的循环数；１０）确定检测样品的ＭＧ７－Ａｇ含量：根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其ＭＧ７－Ａｇ含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈峥，樊代明，吴开春，聂勇战，乔泰东，李泉江，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]