【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一株耐受低盐度寇氏隐甲藻的制备方法及利用碎米水解液提高dha产量的方法。
技术介绍
1、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，简称dha）是一种对人类健康极为重要的多不饱和脂肪酸，对脑部和视觉发育具有关键作用。人体无法高效地自行合成dha，因此需通过饮食摄入。传统上，dha主要通过海洋鱼类及鱼油补充剂获取。然而，鱼腥味、海洋污染以及渔业资源的可持续性问题促使科学家寻找替代的dha来源，微藻成为了一种潜在的、可持续的dha生产来源。尤其是寇氏隐甲藻（ crypthecodinium cohnii）因其能够高效合成dha而受到广泛关注。寇氏隐甲藻能将10~20%的总脂质转化为dha，与此同时，其他多不饱和脂肪酸（pufa）的含量低于1%，且不含有影响婴幼儿发育的epa，显示出其在dha生产上的独特优势。
2、然而，寇氏隐甲藻的商业化生产面临两大挑战：（1）高盐度培养环境的限制：寇氏隐甲藻的培养通常需要高盐度条件，这不仅限制了培养介质的选择范围，还限制了寇氏隐甲藻在不同地区和环境中的应用潜力，此外，还可能引起生物反应器的氯离子腐蚀问题，对设备的长期使用与维护提出了挑战，增加了生产过程的成本和复杂性。（2）成本高昂的碳源：传统培养方法中使用的葡萄糖作为碳源，虽然可以支持微藻的生长和dha的产生，但其成本相对较高，加上使用传统碳源在现有培养技术中往往得到有限的dha产量，限制了大规模生产的经济可行性。
3、关于低盐度环
4、近年来，已有研究尝试通过遗传工程、诱变及适应性进化等手段改善微藻的生产性能，包括耐受低盐度的培养条件。例如，一些研究通过适应性实验室进化培育出了可以在低盐度条件下生长的裂殖壶菌。这些进展表明通过生物技术手段可以有效改善微藻的环境适应性和生产性能。然而，传统的适应性进化采样完全液体筛选方法，过程中并不能有效获得纯系的性状改良菌株，筛选得到的株系遗传背景不单一，长时间传代后有性状丢失风险。此外，关于寇氏隐甲藻在低盐度条件下的耐受性改良及利用碎米水解液提高dha产量的具体实施方案，目前尚未见详细报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一株耐受低盐度寇氏隐甲藻及其制备方法，以及利用碎米水解液提高所述耐受低盐度寇氏隐甲藻的dha产量的方法，解决如下技术问题：
2、纯合进化菌株：固液双相的低盐度实验室适应性进化，结合了液体培养筛选可加速微生物生长和演化，增加固体分离纯化培养则有助于观察和选择具有特定表型的菌株。这种双相结合方式能够充分利用各自的优点，增强整体筛选的有效性，高效地从混合群体中分离出单一微生物，提高了微生物纯化的效率和准确性。通过在液体和固体培养基之间交替，可以更精确地控制微生物的进化路径，便于研究特定环境条件对微生物进化的影响。
3、降低设备腐蚀风险：通过实验室定向进化手段培育一株能在低盐度条件下生长的寇氏隐甲藻，减少氯离子腐蚀对生物反应器的影响，延长设备使用寿命，降低生产成本；
4、降低生产成本：示范案例利用低成本的碎米水解液作为碳源，替代传统的葡萄糖，以降低dha生产的原材料成本；
5、提高dha产量，通过优化培养条件和碳源的选择，利用碎米水解液，提高寇氏隐甲藻的dha产量，增加生产效率和经济效益；
6、提高环境适应性：培育出的耐受低盐度的寇氏隐甲藻株可在更广泛的环境条件下生长，增加了其在不同地区进行商业化生产的可行性和灵活性。
7、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
8、本专利技术提供了制备耐受低盐度的寇氏隐甲藻的方法，包括n轮适应性进化：
9、第1轮适应性进化：
10、步骤（1）：将寇氏隐甲藻接种于海盐浓度低于25 g/l的液体培养基1，培养至对数生长期，再接种于海盐浓度与所述液体培养基1相等的固体培养基1，培养，挑取藻落，再在固体培养基上进行划线分离得到单藻落，比较各藻落生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量，获得生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量最优的半适应藻落；
11、步骤（2）：取步骤（1）所述的半适应藻落重复若干次步骤（1），直至获得生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量超过未驯化的所述寇氏隐甲藻的驯化藻落1；
12、第2轮适应性进化：
13、步骤（3）：将所述驯化藻落1接种于海盐浓度低于所述液体培养基1的海盐浓度的液体培养基2，培养至对数生长期，再接种于海盐浓度与所述液体培养基2相等的固体培养基2，培养，挑取藻落，再在固体培养基上进行划线分离得到单藻落，比较各藻落生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量，获得生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量最优的半适应藻落；
14、步骤（4）：取步骤（3）所述的半适应藻落重复若干次步骤（3），直至获得生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量超过未驯化的所述寇氏隐甲藻的驯化藻落2；
15、第n轮适应性进化：
16、步骤（n）：将驯化藻落n-1接种于海盐浓度为8 g/l的液体培养基n，培养至对数生长期，再接种于海盐浓度与所述液体培养基n相等的固体培养基n，培养，挑取藻落，再在固体培养基上进行划线分离得到单藻落，比较各藻落生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量，获得生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量最优的半适应藻落；
17、步骤（n+1）：取步骤（n）所述的半适应藻落重复若干次步骤（n），直至获得生长速率、葡萄糖消耗速率和脂质含量超过未驯化的所述寇氏隐甲藻的菌株，所述菌株即为耐受低盐度的寇氏隐甲藻。
18、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法所述液体培养基1、所述液体培养基2、所述液体培养基n皆为c9n2液体培养基。
19、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法所述固体培养基1、固体培养基2、固体培养基n为c9n2固体培养基。
20、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法所述接种按照1.8×108/l藻细胞数接种。
21、本专利技术还提供了碎米水解液在提高上述方法制得的寇氏隐甲藻的dha产量中的应用；
22、所述碎米水解液的制备方法包括：将碎米研磨成粉末，获得碎米粉，取水和所述碎米粉混合，糊化，与淀粉酶混合，再与淀粉葡糖苷酶混合，获得所述碎米水解液。
23、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述应用所述水的体积为800 ml；
24、所述碎米粉的质量为80 g；
25、所述糊化的条件为100℃，2 h。
26、本专利技术还提供了dha的生产本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.耐受低盐度的寇氏隐甲藻的制备方法，其特征在于，包括n轮适应性进化：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基1、所述液体培养基2、所述液体培养基n皆为C9N2液体培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基1、固体培养基2、固体培养基n为C9N2固体培养基。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述接种按照1.8×108/L藻细胞数接种。
5.碎米水解液在提高权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的寇氏隐甲藻的DHA产量中的应用；
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水的体积为800 mL；
7.DHA的生产方法，其特征在于，包括取如权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的寇氏隐甲藻接种于培养基，培养，获得DHA；
8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述水的体积为800 mL；
9.如权利要求7或8所述的生产方法，其特征在于，所述碎米水解液占所述培养基的45%(v/v)；
【技术特征摘要】
1.耐受低盐度的寇氏隐甲藻的制备方法，其特征在于，包括n轮适应性进化：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基1、所述液体培养基2、所述液体培养基n皆为c9n2液体培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基1、固体培养基2、固体培养基n为c9n2固体培养基。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述接种按照1.8×108/l藻细胞数接种。
5.碎米水解液在提高权利要求1至...
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