【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寄生虫检测，具体涉及一种用于检测猪肠道寄生性原虫的双重pcr引物组及试剂盒和方法。
技术介绍
1、猪球虫病是由猪囊等孢球虫和多种艾美耳球虫所致，主要危害7～21日龄仔猪，尤其是囊等孢属球虫危害较大。猪球虫病主要临床症状为仔猪腹泻，以及腹泻而引起仔猪脱水甚至死亡的现象，症状较轻时病猪会排出带有粘液和气味的松散糊状粪便，随着病情加重，患猪会排出水样粪便，有时会混杂少量血液，并散发酸臭的腐败气味；成年猪很少出现临床症状，但在饲养过程中会表现出机体脱水、体型消瘦、被毛粗糙、发育迟缓，体重几乎不增加，常呈带虫者，引起猪舍环境受到污染，成为球虫病的传染源；母猪携带球虫，通过粪便排出导致产床污染，使同一栏舍的仔猪感染球虫而发生球虫病，造成养殖业的重大损失。
2、地域和气候也对猪球虫病在仔猪内的发病时间影响较大，最早可在6日龄，最晚可在21日龄表现出腹泻。被感染的大多数仔猪直到21日龄后才能在其粪便中发现猪球虫的卵囊，感染较轻时不表现临床症状。当感染的仔猪发病时会出现无精打采、不喜进食、不喜活动、出现神经症状、被毛杂乱、日渐消瘦的症状，刚开始表现为粪便变稀，随着病程的发展排出的粪便由灰白色或黄白色转为水样粪便，伴有恶臭，大致可分为黏液状、黄色水样、白色凝乳块状三种。对病弱仔猪进行剖检，可直接观察到粪便呈现黄色液状并充满肠道，淋巴结肿胀，肠黏膜出血，病程长者可见肠部分坏死，表面针尖状或成片出血，结节发生坏死、纤维化，肠系膜病变明显，肠粘膜绒毛严重萎缩并且长度变短，表现为坏死性肠炎。
3、随着分子生物学技术的发
4、因此，建立一种迅速、有效的两种肠道寄生虫检测手段对猪球虫病的防治具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种用于检测猪肠道寄生性原虫的双重pcr引物组及试剂盒和方法，其具有灵敏性强、特异性好、检测方便等优点。
2、为实现本专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案如下：用于检测猪肠道寄生性原虫的双重pcr引物组，其特征在于：所述的引物组中含有分别用于检测猪囊等孢球虫和艾美耳属球虫的任意一项或者两项特异性引物。
3、所述猪囊等孢球虫上游引物cs18s-f的序列为：5’-catggataaccgtggtaattctatgg-3’；
4、所述猪囊等孢球虫下游引物cs18s-r的序列为：5’-ggtgcaggagaagtcaagtatg-3’；
5、所述猪艾美耳属球虫上游引物escoⅰ-f的序列为：5’-gctgttctaggtgtaaccaatg-3’；
6、所述猪艾美耳属球虫上游引物escoⅰ-r的序列为：5’-cctaggacta ctccagtagtac-3’；
7、一种用于检测猪肠道寄生性原虫的试剂盒在检测猪囊等孢属球虫和艾美耳球虫任意一种或两种中的应用。
8、一种用于检测猪肠道寄生性原虫的双重pcr方法，步骤为：
9、1)提取待测样品的dna；
10、2)利用引物组进行双重pcr扩增，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s、56.2℃退火30s、72℃延伸1min，反应35个循环；72℃最终延伸10min；
11、3)将pcr反应产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
12、所述双重pcr反应体系包括
13、10×ex taq buffer 2.50μl、
14、dntp 2.00μl、
15、mgcl22.40μl、
16、ex taq dna聚合酶0.125μl、
17、猪囊等孢球虫特异性引物cs18s-f(10μmol/l)和cs18s-r(10μmol/l)各1.00μl、
18、猪艾美耳属球虫特异性引物escoⅰ-f(10μmol/l)和escoⅰ-r(10μmol/l)各1.25μl、
19、待检测dna模板2.0μl，补足ddh2o至25μl。
20、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和效果：
21、1、本专利技术分别基于猪囊等孢球虫ssu rrna基因和艾美耳属球虫coⅰ基因设计特异性引物，并经过不同引物组合筛选得到扩增效果最优的引物组合，通过优化退火温度和引物浓度，最终建立可以同时检测两种或单一猪肠道寄生性原虫的特异性双重pcr方法。
22、2、本专利技术引物组和双重pcr方法可以通过一次双重pcr反应即可确定待检样品中猪等孢球虫和艾美耳属球虫的混合感染和单一感染情况，较单一pcr方法更加高效成本更低。
23、3、本专利技术利用pcr方法检测可直接区分出未孢子化的猪囊等孢属和艾美耳属球虫，并且对粪便中卵囊少的无症状带虫者也能检测出，这是其它检测方法都无法比拟的。
24、4、本专利技术方法具有特异性强、检测灵敏度高、操作简单等特点，适用于临床检测，为猪肠道寄生性原虫的诊断和防控提供技术支持。
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1.用于检测猪肠道寄生性原虫的双重PCR引物组，其特征在于：所述的引物组中含有分别用于检测猪囊等孢球虫和猪艾美耳属球虫的任意一项或者两项特异性引物。
2.根据权利要求1所述的用于检测猪肠道寄生性原虫的双重PCR引物组，其特征在于：
3.一种用于检测检测猪肠道寄生性原虫的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的双重PCR引物组。
4.一种用于检测猪肠道寄生性原虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒在检测猪囊等孢球虫和艾美耳属球虫任意一种或两种中的应用。
5.一种用于检测猪肠道寄生性原虫的双重PCR方法，其特征在于：步骤为：
6.根据权利要求5所述的一种用于检测猪肠道寄生性原虫的双重PCR方法，其特征在于：所述双重PCR反应体系包括
【技术特征摘要】
1.用于检测猪肠道寄生性原虫的双重pcr引物组，其特征在于：所述的引物组中含有分别用于检测猪囊等孢球虫和猪艾美耳属球虫的任意一项或者两项特异性引物。
2.根据权利要求1所述的用于检测猪肠道寄生性原虫的双重pcr引物组，其特征在于：
3.一种用于检测检测猪肠道寄生性原虫的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的双重pcr引...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋军科，任尊，赵光辉，房凯敏，陈昊，刘敬睿，杨新，林青，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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