【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体涉及一种cha反应与sers检测相结合的mirnas检测方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、微小rna(microrna，mirna)是一种非编码的小rna，其长度为18-25个核苷酸，通过结合靶基因的3′-非翻译区诱导mrna的降解或抑制其翻译来参与了细胞分裂、分化、形态学变化、代谢和凋亡等多种生物学过程。有研究表明，随着基因组和表观遗传的改变，mirna的基因组也会发生异常，突变形式包括缺失、重复、易位等。calin等发现大于50％的mirna基因位于癌症相关的基因区，并作为原癌基因或肿瘤抑制因子调控肿瘤的发生。还有研究发现，各型的癌都有其特异性表达的mirna，这些mirna或可作为生物标志物用于鉴别不同类型的癌。大量mirna表达异常并调节多种信号通路，其产生的生物学效应共同促进了癌症的发生、发展。因此，在恶性程度高、侵袭性强、预后较差的癌症中，mirna或可作为潜在生物标志物应用于临床进行早期的筛检，提高患者生存率。mirna作为生物标志物应用在乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌的诊断和治疗中取得了较好的效果。mirna可作为一种无创、低成本的生物标志物，通过循环检验等手段应用于临床诊断，减轻患者在诊断过程中的痛苦，并且达到早诊断、早治疗的目的。mirna具有足量、在血液中稳定存在、不易被rna酶降解等优点，这与临床诊断需求相吻合。
2、常规的mirna检测方法包括northern印迹、定量逆转录酶聚合酶链反应(qrt-pcr)和微阵列法。然而，这些方法均存在一些缺陷，如northe
3、传统的mirna检测方法已经不能满足当前的需求，各种纳米材料已被应用于mirna检测的研究，例如金纳米颗粒(aunps)、磁性纳米粒子、银纳米簇(agncs)和量子点(qd)。由于其高表面积、优异的导电性和显著的化学稳定性，纳米材料可以成为提高经典检测方法性能的强大工具。如aunps具有很强的表面等离子体共振吸收和高消光系数，在分析方法的开发中得到了最广泛的应用。基于aunps的比色测定，无需借助先进的仪器，为mirna检测提供了一种经济高效、快速且方便的选择。aunp在传感基板的制造中起着重要作用，通过au-s键结合目标捕获探针。靶标触发的aunps聚集，导致aunps溶液的颜色从红色变为紫色，响应分散和聚集纳米颗粒的表面等离子体共振吸收，作为光学检测的基础。
4、表面增强拉曼散射(sers)是1974年首次报道的粗糙银电极光谱分析新方法，已成为许多研究领域的重要工具。由于sers技术极大地改善了拉曼信号，甚至可以提供独特的单分子指纹峰，具有很高的特异性，因此sers被广泛应用于有机污染物分析、重金属离子检测、蛋白质测量等。随着拉曼光谱的快速发展和疾病诊断的迫切需要，sers被广泛应用于分析与疾病相关的mirnas。sers纳米传感器在mirna检测方面有许多独特的优点。首先，由于sers的高灵敏度，实现了超灵敏的mirna检测。其次，sers的快速检测将促进mirna成为临床诊断的实用指标。第三，sers独特的指纹峰可以保证同时检测多个mirnas。此外，mirnas的长度适合产生等离子体“热点”，可以大大提高sers的信号。随着sers技术和纳米技术的发展，sers纳米传感器在mirna检测方面将会有更多独特的优势。由于mirna通常存在于复杂的生物环境中，分析过程通常会受到各种物质的干扰。此外，mirna很容易降解，有时多个同源mirna同时存在。为了满足同时检测mirna、高通量mirna检测、超灵敏mirna检测等需求，人们开发了不同的检测手段。新型纳米材料已被合成并用作探针，等离子体材料已被制备为sers活性底物，多种核酸扩增策略已被报道，不同的放大元件经常组合在一起。例如当待检测物中mirna浓度较低时，为了提高检测灵敏度，基于核酸扩增的方法，如滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)、催化发卡组装(cha)等，已被广泛用于mirna的高灵敏度检测。这些新技术加速了mirna功能研究和临床诊断。cha作为一种无酶体系、低背景信号、操作简单的等温扩增技术，已经作为核酸扩增和mirna检测的典型方法。此外，cha扩增可以实现数百倍的扩增效率，并且cha克服了一些酶促扩增反应依赖温度以及复杂流程的局限性，具有良好的应用前景。
5、到目前为止，尚未有将基于检测平台上功能性cha与可调控aunps所响应的sers信号收集相结合用于mirna检测的相关报道。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种mirnas检测方法、试剂盒及其应用，首次将cha与sers进行组合，利用aunps的优异性质和所构建的富集检测模式，形成了关联性强的循环扩增sers检测系统，从而实现了对mirna的超灵敏检测，并且检测流程短，成本低，有望应用于制备癌症诊断产品。
2、本专利技术所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
3、本专利技术的目的之一是提供一种mirnas检测试剂盒，包括cha反应试剂和sers检测平台，所述cha反应试剂由au nps、4-atp、发卡探针hp1和发卡探针hp2组成，所述sers检测平台由样品垫、硝酸纤维素膜(nc膜)、吸收垫和底板组成，所述硝酸纤维素膜上修饰有链霉亲和素。
4、所述发卡探针hp1的核苷酸序列如下所示：
5、5′-tcaacatcagtctgataagctagatgttgaaacctagctagcttat cagact(sh)-3′；
6、所述mirnas为mirna-21，mirna-21的核苷酸序列如下所示：
7、5′-uagcuuaucagacugauguuga-3′；
8、所述发卡探针hp2的核苷酸序列如下所示：
9、5′-taagctagctaggtttcaacatctagcttatcagagagatgttga aacctagccctt(bio)-3′。
10、本专利技术的目的之二是提供一种mirnas检测方法，使用所述mirnas检测试剂盒，具体操作步骤如下：
11、步骤1：将au nps与4-atp混匀后静置，随后加入发卡探针hp1进行孵育，得到4-atp@au@hp1；
12、步骤2：向4-atp@au@hp1中加入发卡探针hp2与目标mirna进行反应，得到4-atp@au@hp1/hp2产物；
13、步骤3：将4-atp@au-cha产物滴至样品垫上，通过肉眼观察硝酸纤维素膜的显色情况进行mirnas的定性检测，待硝酸纤维素膜显色后使用便携式拉曼光谱仪进行拉本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种miRNAs检测试剂盒，其特征在于：包括CHA反应试剂和SERS检测平台，所述CHA反应试剂由Au NPs、4-ATP、发卡探针HP1和发卡探针HP2组成，所述SERS检测平台由样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和底板组成，所述硝酸纤维素膜上修饰有链霉亲和素；
2.根据权利要求1所述的miRNAs检测试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜平铺在底板上，所述样品垫与吸收垫分别叠放在硝酸纤维素膜的两端上，所述样品垫与硝酸纤维素膜、吸收垫与硝酸纤维素膜之间部分重叠。
3.根据权利要求1所述的miRNAs检测试剂盒，其特征在于：所述Au NPs采用柠檬酸盐还原法制备。
4.一种miRNAs检测方法，其特征在于：使用权利要求1-3任意一项所述的miRNAs检测试剂盒，具体操作步骤如下：
5.权利要求1-3任意一项所述的miRNAs检测试剂盒或权利要求4所述的miRNAs检测方法在制备癌症诊断产品中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种mirnas检测试剂盒，其特征在于：包括cha反应试剂和sers检测平台，所述cha反应试剂由au nps、4-atp、发卡探针hp1和发卡探针hp2组成，所述sers检测平台由样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和底板组成，所述硝酸纤维素膜上修饰有链霉亲和素；
2.根据权利要求1所述的mirnas检测试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜平铺在底板上，所述样品垫与吸收垫分别叠放在硝酸纤维素膜的两端上，所述样品垫与...
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