【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种非转基因或同源重组基因编辑的方法，特别是指一种细菌基因编辑的方法及其应用。
技术介绍
1、细菌的基因组编辑是探究细菌代谢、表达调控等过程的基础，目前应用最广的方式是利用crispr-cas系统进行基因编辑过程。传统的细菌基因编辑需要针对目的基因构建表达载体，对细菌进行转基因操作，利用筛选标记对转化子筛选，之后往往都需要对转入细菌的外源质粒进行消除操作，该过程较为繁琐，且质粒的最终彻底消除难度较大。公开号为cn114630910a的专利公开了一种改善的同源依赖修复基因组编辑，该方法为针对真核细胞基因组的靶编辑位点的基因组修饰方法，该方法为用于真核细胞或生物体的靶基因的转基因编辑方法。
2、化脓性链球菌的cas9蛋白(spcas9)是目前应用最广泛的基因编辑工具，这主要是由于其对pam 序列的需求5’-ngg-3’(其中n可以是任何核苷酸)相对常见。cas9蛋白在pam上游约3bp处引发双链断裂（dsb），随后，细胞通过非同源末端修复这些 dsb 连接（nhej）或同源重组（hr）修复。由于细菌普遍缺少同源重组修复系统，非同源重组修复能力也弱，导致利用crispr基因编辑在细菌中应用时效率低甚至无效。nhej途径需要ku和ligd两种蛋白参与，在原核生物中是一个很弱的过程，不足以修复dsb或者修复效率极低，在大肠杆菌中就缺乏nhej修复机制。从2013年首次利用λ-red重组系统介导hr途径在大肠杆菌中应用后，crispr-cas9系统逐渐在枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、恶臭假单胞菌等更多种类
3、现有的非转基因 crispr/cas 基因编辑即是利用 rnp 进行基因编辑， 目前在细菌中应用crispr-cas系统无论进行非同源重组（nhej）修复还是同源重组（hr）修复都是需要通过构建含有重组酶基因的质粒载体转入受体细胞实现基因编辑，完成编辑后一般都需要对质粒进行消除操作，而我们发现消除效果往往不理想。且细菌缺乏dsb修复能力，但由于没有导入双链dna断裂（double-strand dna breaks，dsb）修复蛋白，要依赖体内 dsb 修复系统，而体内 dsb 修复系统以非同源重组为主，且与细胞的生理状态密切有关，基因编辑结果难以预测，体外优化的结果在体内难以重现。为了研究在不依赖体内 dsb 修复系统时，仍具有高效的基因编辑效率，本申请进行了深入的探索。建立一种更为便捷且无需构建载体的基因编辑策略。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出一种细菌基因编辑的方法及其应用。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本申请通过将cas9蛋白与目标基因的sgrna构成rnp复合物，与ssb蛋白（single-stranded dna binding protein，ssb）结合形成rnp+ssb复合物，再通过脂质体转染试剂介导形成共同转入细菌原生质体，实现对目标基因的非转基因非同源重组基因编辑；
4、或者将rnp+ssb复合物加入donor dna片段和脂质体转染试剂，包括：单链寡核苷酸供体（single-strandedoligodeoxynucleotide donor，ssodn donor）dna或含有四环素抗性基因的双链寡核苷酸供体（tetracycline-resistant double-strandedoligodeoxynucleotides，tr-dsodndonor），共同转入细菌原生质体实现对目标基因的同源重组基因编辑。
5、一种对细菌进行基因编辑的方法，步骤为：
6、（1）制备细菌的原生质体，合成目标基因的sgrna；
7、（2）分别构建目标基因的单链寡脱氧核苷酸供体（ssodn donor)和含抗性基因的双链寡脱氧核苷酸供体（tr-dsodn donor)，作为dna供体模板，用于rnp+ssb介导的同源重组；
8、（3）将sgrna溶液和cas9溶液混合共孵育得到rnp复合物，再与脂质体转染试剂混合、静置得到rnp转化体系；
9、（4）将rnp复合物与ssb溶液混合共孵育得到rnp+ssb复合物；
10、（5）将rnp+ssb复合物与以下任一种情况对应的物质混合，静置得rnp+ssb转化体系；
11、①脂质体转染试剂，此种情况进行的是非转基因非同源重组基因编辑；
12、②ssodn donor溶液和脂质体转染试剂，此种情况进行的是同源重组基因编辑；
13、③tr-dsodn donor溶液和脂质体转染试剂，此种情况进行的是同源重组基因编辑；
14、（6）将步骤（5）中的rnp+ssb转化体系分别与步骤（1）的原生质体混合，加入高渗再生培养基振荡培养，涂布于筛选培养基上，经验证成功的即为编辑成功的细菌。
15、上述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
16、进一步的，上述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或假单胞菌。
17、进一步的，上述步骤（1）中目标基因为upp基因等各种细菌基因组中的目标基因区域。
18、上述步骤（2）中抗性基因为抗生素抗性基因。
19、进一步的，上述抗性基因为四环素抗性基因或其他原核细胞中可以表达的抗性基因，如卡那抗性基因、氨苄抗性基因等。
20、优选的，上述步骤（3）、（4）、（5）中sgrna溶液的浓度为1000ng/μl、cas9溶液的浓度为10mg/ml、ssb溶液的浓度为10mg/ml、ssodn donor与tr-dsodn donor溶液的浓度均为200ng-600ng/μl、脂质体转染试剂为脂质体3000（lipofectamine™ 3000）(waltham, ma,usa)。
21、上述sgrna溶液、cas9溶液、ssb溶液、ssodn donor或tr-dsodn donor溶液和脂质体转染试剂的体积比为4:6:5:10:20。
22、上述各种转化体系孵育的温度为37℃、时间为30min。
23、上述步骤（5）中rnp转化体系与步骤（1）的原生质体的体积比为9:10；
24、孵育的温度为37℃，rnp复合物的孵育时间为20min，rnp+ssb复合物的孵育时间为30min。
25、上述步骤（6）中rnp+ssb转化体系与步骤（1）的原生质体的体积比为9:10；筛选培养基为含有可针对目标基因缺失进行筛选的化合物的高渗再生培养基，转入tr-dsodndonor的转化体系选用培养基为含有可针对目标基因缺失进行筛选的化合物，同时含有抗性基因表达的抗生素的高渗再生培养基；其中含有可针对目标基因缺失进行筛选的化合物，以upp基因为例，该化合物为5氟尿嘧啶。
26、上述的方法在细菌进行非转基因基因编辑中的应用，所述rnp+ssb转化体系的制备采用步骤（5）中的第①中情况：rnp+ssb本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细菌基因编辑的方法，其特征在于，步骤为：
2.根据权利要求1所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
3.根据权利要求1所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或假单胞菌。
4.根据权利要求3所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤（1）中目标基因为细菌基因组中的基因；步骤（2）中抗性基因为抗生素抗性基因。
5.根据权利要求1-4任一项所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：sgRNA溶液的浓度为1000ng/μL、Cas9溶液的浓度为10mg/mL、SSB溶液的浓度为10mg/mL、ssODN donor与Tr-dsODN donor溶液的浓度均为200ng-600ng/μL、脂质体转染试剂为Lipofectamine™ 3000。
6.根据权利要求5所述的对细菌进行体内非转基因或同源重组基因编辑的方法，其特征在于：所述sgRNA溶液、Cas9溶液、SSB溶液、ssODN donor或Tr-dsODN donor溶液和脂质体转染试剂的体积比
7.根据权利要求6所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：孵育的温度为37℃，RNP复合物的孵育时间为20min，RNP+SSB复合物的孵育时间为30min。
8.根据权利要求7所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤（6）中RNP+SSB转化体系与步骤（1）的原生质体的体积比为9:10；筛选培养基为含有可针对目标基因缺失进行筛选的化合物的高渗再生培养基，转入Tr-dsODN donor的转化体系选用培养基为含有可针对目标基因缺失进行筛选的化合物，同时含有抗性基因表达的抗生素的高渗再生培养基。
9.权利要求1-4、6-8任一项所述的方法在细菌进行非转基因基因编辑中的应用，其特征在于，所述RNP+SSB转化体系的制备采用步骤（5）中的第①中情况：RNP+SSB复合物仅与①脂质体转染试剂混合。
10.权利要求1-4、6-8任一项所述的方法在细菌进行同源重组基因编辑中的应用，其特征在于，所述RNP+SSB转化体系的制备采用步骤（5）中的第②或③中情况：RNP+SSB复合物与②ssODN donor溶液和脂质体转染试剂或③Tr-dsODN donor溶液和脂质体转染试剂混合。
...【技术特征摘要】
1.一种细菌基因编辑的方法，其特征在于，步骤为：
2.根据权利要求1所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
3.根据权利要求1所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或假单胞菌。
4.根据权利要求3所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：所述步骤（1）中目标基因为细菌基因组中的基因；步骤（2）中抗性基因为抗生素抗性基因。
5.根据权利要求1-4任一项所述的细菌基因编辑的方法，其特征在于：sgrna溶液的浓度为1000ng/μl、cas9溶液的浓度为10mg/ml、ssb溶液的浓度为10mg/ml、ssodn donor与tr-dsodn donor溶液的浓度均为200ng-600ng/μl、脂质体转染试剂为lipofectamine™ 3000。
6.根据权利要求5所述的对细菌进行体内非转基因或同源重组基因编辑的方法，其特征在于：所述sgrna溶液、cas9溶液、ssb溶液、ssodn donor或tr-dsodn donor溶液和脂质体转染试剂的体积比为4:6:5:10:20。
...【专利技术属性】
技术研发人员：柴冉，郭稼祥，耿悦，黄帅，姚新鼎，邱立友，
申请(专利权)人：黄河水利职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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