【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体和基因工程菌及其应用。
技术介绍
1、香兰素(vanillin)，又称香草醛，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛。其分子式为c8h8o3，相对分子量152。香兰素纯品为白色或淡黄色粉末状或针状晶体，具有香荚兰豆的香气及浓烈的奶香。香兰素因其独特的、无法用人工方法复合的香气特性和广泛的应用范围被誉为“香料皇后”，广泛应用于食品、医药、饲料及调味品、化妆品行业。
2、目前市场上的香兰素包括天然香兰素和合成香兰素：由植物中提取获得的天然香兰素因植物种植周期长、香兰素提取工艺复杂，产量极为有限且价格昂贵，只能提供不到1％的年市场需求。与天然香兰素相比，通过化学法获得的合成香兰素产量大且价格极低，因而合成香兰素占据了绝大部分的香兰素调味品市场。然而，通过化学工艺生产的合成香兰素副产物较多、产品质量较低且易对人类健康造成不良影响，在食品和制药行业的使用受到严格限制。
3、微生物转化法由于以天然物质为底物并采用生物转化方法，所获得的香兰素被认为是“天然香兰素”。自然界中的多种微生物如链霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌、朱红密孔菌、肠杆菌等，可转化不同底物合成香兰素，通过对其相关酶和基因的发掘和鉴定，及代谢途径和发酵条件的研究，为基因工程改造提升香兰素产量，通过微生物转化法大规模生产香兰素提供更多选择与机会。
4、专利cn106754802a对来自pseudomonas putida ie27的异丁香酚单加氧酶进行氨基酸突变，努力提高该酶的活力，但是活
5、因此，研发一种生产安全、酶活力高、转化效率高、适用于大规模的香兰素生产方法是当前研究的热点。
技术实现思路
1、针对上述不足，本专利技术提供了4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体和基因工程菌及其应用。本专利技术对4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的口袋中心位点进行突变，其突变体t216m、t216l、s280m、g307p、m351f的酶活是突变之前的1.04-2.29倍。100mmol/l底物浓度，香兰素转化率为67.9％-88.44％，产量达10.32-13.44g/l。利用本专利技术提供的iso突变体能够高效催化4-乙烯基愈创木酚生成香兰素，具有良好的工业应用前景。
2、
3、术语：
4、本专利技术中，术语“v58w”代表将第58位的缬氨酸v突变为色氨酸w。
5、本专利技术中，术语“t216m”代表将第216位的苏氨酸t突变为甲硫氨酸m。
6、本专利技术中，术语“t216l”代表将第216位的苏氨酸t突变为亮氨酸l。
7、本专利技术中，术语“s280m”代表将第280位的丝氨酸s突变为甲硫氨酸m。
8、本专利技术中，术语“g307p”代表将第307位的甘氨酸g突变为脯氨酸p。
9、本专利技术中，术语“m351f”代表将第351位的甲硫氨酸m突变为苯丙氨酸f。
10、本专利技术的技术方案为：
11、一方面，本专利技术提供了一种4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括对4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的口袋中心位点进行突变；所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12、seq id no.1：
13、mpnypqtihfvglntpvgiewsarnldvigtipaeidgaffravpdpahppmfdddivlsgdgmvakfaihdgkvdyairyveteryrlekdarralfgqyrnpftddasvagrdrtvanttpvwhggrllmtkedglgyqvdpdtletlgrfdyygalksqtftahprvdpetgemfffgyeadglcstkisyaiadrdgkliseqwfdqpycstihdfaitehyaifpifpttadldrlkaggahwahqqdleswvgimprygkveemrwfkgrngvsafhlvnayeedgfvhldlclsdtnafgfmreaggiqrdqrdiqggltrwtfdlskegdmfeerlvgppgdmprlrdadqgrpyraawylsmnpqggpplpggpvgvafnallriepgngridmmglepgmaisepvhvpstqdehegwllmvvdrqageadfkselwvveagaiaagpiarvpmpmpmraqvhgawvsarqlanarqnvdseaa。
14、具体地，所述的口袋中心位点为seq id no.1的第216位、第280位、第307位、第351位中的任意一个或多个位点。
15、进一步具体地，所述的突变包括将第216位的苏氨酸t突变为甲硫氨酸m。
16、进一步具体地，所述的突变包括将第216位的苏氨酸t突变为亮氨酸l。
17、进一步具体地，所述的突变包括将第280位的丝氨酸s突变为甲硫氨酸m。
18、进一步具体地，所述的突变包括将第307位的甘氨酸g突变为脯氨酸p。
19、进一步具体地，所述的突变包括将第351位的甲硫氨酸m突变为苯丙氨酸f。
20、优选地，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括：
21、(1)将第216位的苏氨酸t突变为甲硫氨酸m的突变体t216m；或
22、(2)将第216位的苏氨酸t突变为亮氨酸l的突变体t216l；或
23、(3)将第280位的丝氨酸s突变为甲硫氨酸m的突变体s280m；或
24、(4)将第307位的甘氨酸g突变为脯氨酸p的突变体g307p；或
25、(5)将第351位的甲硫氨酸m突变为苯丙氨酸f的突变体m351f。
26、进一步优选地，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括如seq id no.2-6所示的氨基酸序列。
27、所述的突变体t216m具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。
28、seq id no.2：
29、mpnypqtihfvglntpvgiewsarnldvigtipaeidgaffravpdpahppmfdddivlsgdgmvakfaihdgkvdyairyveteryrlekdarralfgqyrnpftddasvagrdrtvanttpvwhggrllmtkedglgyqvdpdtletlgrfdyygalksqtftahprvdpetgemfffgyeadglcstkisyaiadrdgkliseqwfdqpycsmihdfaitehyaifpifpttadldrlkaggahwahqqdleswvgimprygkveemrwfkgrngvsafhlvnayeedgfvhldlclsdtnafgfmreaggiqrdqrdiqggltrwtfdlske本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括对4-乙烯基愈创木酚加氧酶Iso的口袋中心位点进行突变；
2.根据权利要求1所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括：
3.根据权利要求2所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括如SEQ ID NO.2-6所示的氨基酸序列。
4.一种编码基因，其特征在于，所述的编码基因用于编码权利要求1-3任一项所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体。
5.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体携带权利要求4所述的编码基因。
6.一种基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株包含权利要求5所述的重组载体，异源过表达Iso突变体。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株以重组质粒pET28a-Iso为模板，利用引物进行体外突变扩增后，转入大肠杆菌。
8.一种基因工程制剂，其特征在于，所述基因工程
9.权利要求1-3任一项所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体、权利要求4所述的编码基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6-7任一项所述的基因工程菌株或权利要求8所述的基因工程制剂在合成香兰素中的应用。
10.一种合成香兰素的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3任一项所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体、权利要求4所述的编码基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6-7任一项所述的基因工程菌株或权利要求8所述的基因工程制剂。
...【技术特征摘要】
1.一种4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括对4-乙烯基愈创木酚加氧酶iso的口袋中心位点进行突变；
2.根据权利要求1所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括：
3.根据权利要求2所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体，其特征在于，所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体包括如seq id no.2-6所示的氨基酸序列。
4.一种编码基因，其特征在于，所述的编码基因用于编码权利要求1-3任一项所述的4-乙烯基愈创木酚加氧酶突变体。
5.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体携带权利要求4所述的编码基因。
6.一种基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株包含权利要求5所述的重组载体，异源过表达iso突变体。
7.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑良振，成丽丽，侯丽丽，谢东奇，丁霈希，吴秋秋，朱国梁，代陈胜，戴进，吴冬，王晟，
申请(专利权)人：上海智峪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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