【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基及其应用。
技术介绍
1、crfk细胞（crandell reese feline kidney）是一种猫肾细胞，由猫肾原代细胞通过克隆筛选转化而成连续传代细胞系，体外培养呈贴壁生长。crfk细胞对多种宠物病和特产经济动物病病毒比较敏感，如猫疱疹病毒（feline herpesvirus, fhv）、猫嵌杯状病毒（feline calicivirus, fcv）、猫细小病毒（feline panleukopenia virus, fpv）、犬细小病毒（canine parvovirus, cpv）、犬瘟热病毒（canine distemper virus, cdv）、犬冠状病毒（canine coronavirus, ccov）、水貂病毒性肠炎病毒（mink enteritis virus, mev）、水貂阿留申病毒（aleutian mink disease virus, amdv）等，可广泛应用于这几种病毒性疫苗的制备。
2、由于crfk细胞有较强的贴壁依赖性，即一般情况下，体外培养只能在固定介质表面贴壁，才能够生长增殖，所以，体外培养依赖培养介质，如方瓶、细胞工厂、转瓶、微载体、片状载体等。目前crfk细胞使用常规培养基（如dmem、mem）等添加一定浓度血清进行贴壁培养。病毒培养制备流程一般如下，使用传统培养基（如mem、dmem）添加5-10%血清培养细胞，待细胞长满后，弃去培养液，加入细胞消化液（如胰蛋白酶）使细胞脱落分散
3、基于以上的模式，一方面，需要使用血清，血清是个成分不明确的混合物，极易带来外源性污染风险，而且批次差异大；另一方面，细胞培养过程工艺复杂，需要将细胞进行消化操作才能将培养规模放大，放大规模受限于培养介质的数量。
4、目前，动物细胞大规模悬浮培养工艺已在一些疫苗和抗体生产中应用，比如bhk21细胞悬浮培养生产口蹄疫病毒、狂犬病毒，mdck细胞无血清悬浮培养流感病毒、禽流感病毒，而bhk21、mdck的原始细胞均为贴壁依赖型细胞，在合适的培养基和细胞适应筛选条件下可获得相应的悬浮细胞，进而实现悬浮培养，甚至无血清悬浮培养。
5、但目前市场上无适合crfk细胞无血清悬浮培养的商品化培养基。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基及其应用从而解决或者至少缓解了现有技术中存在的上述问题和其它方面的问题中的一个或多个。
2、为实现前述目的，根据本专利技术的第一方面提供一种用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基，其包含如下组分：
3、
4、在如前所述的用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基中，可选地，所述培养基包含以下含量的各组分：
5、
6、根据本专利技术的第二方面，提供如上所述的培养基在驯化crfk贴壁细胞为无血清悬浮细胞中应用。
7、根据本专利技术的第三方面，提供如上所述的培养基在扩增病毒或制备疫苗中的应用。
8、在如上所述的应用中，可选地，扩增病毒或制备疫苗中使用的病毒是crfk细胞的敏感病毒，包括但不限于猫疱疹病毒、猫嵌杯状病毒、猫细小病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、水貂病毒性肠炎病毒、水貂阿留申病毒。
9、根据本专利技术的第四方面，提供一种驯化crfk贴壁细胞为无血清悬浮细胞的方法，其特征在于，包括：
10、a) 将单层crfk贴壁细胞消化分散后重悬于如以上本专利技术的第一方面所述的用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基+5%血清的细胞培养液中，悬浮培养；
11、b) 将a)中获得的悬浮crfk细胞继续培养2~3天后离心收集上清液，将该上清液与如以上本专利技术的第一方面所述的培养基等体积比混合后用于培养离心收集的crfk细胞，之后重复以上操作，采用将上清液等比例逐代置换的方法，将血清浓度逐步地降低至2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、完全无血清培养；
12、c) 若细胞在完全无血清培养基中稳定连续传代增殖，则得到驯化的细胞。
13、根据本专利技术的第五个方面，提供一种扩增病毒的方法，其特征在于，包括：
14、a) 使用如以上本专利技术的第一方面所述的用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基对驯化的crfk无血清悬浮细胞进行悬浮培养，得到细胞培养液，
15、b) 在细胞培养液中接种病毒进行培养。
16、在如上所述的扩增病毒的方法中，可选地，当crfk细胞密度达到1×106个/ml以上时，按照moi=0.0001-10接种病毒，控制培养温度为30-37.5℃、ph6.8-7.5、do 20-80%，转速30-200 rpm。
17、在如上所述的扩增病毒的方法中，可选地，所述病毒包括但不限于猫疱疹病毒、猫嵌杯状病毒、猫细小病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、水貂病毒性肠炎病毒、水貂阿留申病毒。
18、根据本专利技术的第六方面，提供一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括：
19、a) 根据如以上本专利技术的第五方面所述的方法扩增病毒，
20、b) 得到的病毒液进行减毒或灭活处理。
21、本专利技术的有益效果：
22、本专利技术采用crfk细胞无血清全悬浮培养基，使细胞和病毒的培养均处于悬浮状态，避免了贴壁细胞需要消化、操作繁琐的问题，使得crfk细胞和敏感病毒的放大培养较易实现；避免使用血清，降低成本的同时有利于病毒质量的提高，因为血清是一种可能含有不明成分和造成外源污染的物质，且批次差异大；不使用消化液、血清和载体，可降低培养成本。
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1.一种用于无血清悬浮培养CRFK细胞的培养基，其特征在于，其包含如下组分：
2.根据权利要求1所述的用于无血清悬浮培养CRFK细胞的培养基，其中，所述培养基包含以下含量的各组分：
3.根据权利要求1或2所述的培养基在驯化CRFK贴壁细胞为无血清悬浮细胞中应用。
4.根据权利要求1或2所述的培养基在扩增病毒或制备疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中扩增病毒或制备疫苗中使用的病毒是CRFK细胞的敏感病毒，包括但不限于猫疱疹病毒、猫嵌杯状病毒、猫细小病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、水貂病毒性肠炎病毒、水貂阿留申病毒。
6.一种驯化CRFK贴壁细胞为无血清悬浮细胞的方法，其特征在于，包括：
7.一种扩增病毒的方法，其特征在于，包括：
8. 根据权利要求7所述的扩增病毒的方法，其中，当CRFK细胞密度达到1×106个/ml以上时，按照MOI=0.0001-10接种病毒，控制培养温度为30-37.5℃、pH6.8-7.5、DO 20-80%，转速30-200 rpm。
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10.一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基，其特征在于，其包含如下组分：
2.根据权利要求1所述的用于无血清悬浮培养crfk细胞的培养基，其中，所述培养基包含以下含量的各组分：
3.根据权利要求1或2所述的培养基在驯化crfk贴壁细胞为无血清悬浮细胞中应用。
4.根据权利要求1或2所述的培养基在扩增病毒或制备疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中扩增病毒或制备疫苗中使用的病毒是crfk细胞的敏感病毒，包括但不限于猫疱疹病毒、猫嵌杯状病毒、猫细小病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、水貂病毒性肠炎病毒、水貂阿留申病毒。
6.一种驯化...
【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，孙奇威，方芳，
申请(专利权)人：上海源培生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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