【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种分离寡核苷酸池中单链dna的方法及其应用。
技术介绍
1、寡核苷酸池是一种分子生物学工具，用于合成或分析寡核苷酸(dna或rna)序列的混合物。这种池通常包含大量不同的寡核苷酸序列，可以具有各种长度和组合。寡核苷酸池通常用于高通量测序、基因组学研究和分子生物学实验中，具有灵活性和高吞吐量，在现代生物医学研究中发挥着重要作用。
2、迄今为止，研究人员一直在寻找从粗混合物中捕获寡核苷酸或pcr产物，然后再将其以纯的且具有生物活性的形式释放出来的方法。在以往的研究中，多采用链霉亲和素磁珠以非共价结合的方式来捕获生物素标记的dna，然后再通过热变性或者碱变性处理将dna从磁珠上释放出来，以达到dna纯化和富集的目的。
3、上述方法将双链dna变性，使互补的正义链和反义链分开，但是同时也会导致生物素和链霉亲和素之间的非共价键断裂，最终无法达到理想的分离纯化效果。因此，基于非共价键结合的分离纯化技术对于单纯的单链dna或双链dna纯化是可行的，但不适用于从互补的双链中分离其中的单链dna。
4、cn115232863a公开了一种富集dna的方法，所述方法包括将dna提取液中加入缓冲液和生物素标记的核酸探针，混匀后经过变性、退火冷却至室温，加入表面标记有链霉亲和素的磁珠，加热到80℃以上，保持一段时间后，取上清溶液，获得富集的外源dna片段。
5、为了克服上述的问题，也可以采用共价结合的方式，比如利用-nhs-nh2-或者-cooh-nh2-进行固相偶联，这种结合
6、综上所述，如何从寡核苷酸池中分离单链dna，已成为目前本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种分离寡核苷酸池中单链dna的方法及其应用。通过在固相芯片表面修饰n-羟基丁二酰亚胺，从双链dna池中将目标单链分离出来，获得的单链dna的5’端是磷酸基团，3’端是羟基，不影响其下游应用。
2、第一方面，本专利技术提供了一种分离寡核苷酸池中单链dna的方法，使用表面修饰有n-羟基丁二酰亚胺的固相芯片分离所述单链dna。
3、本申请通过在固相芯片表面修饰n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，与寡核苷酸池中双链dna结合，偶联效率高，再结合热变性和紫外照射手段获得目标单链dna，获得的单链dna池不含非天然碱基官能团或可能影响下游应用的疤痕，具有广阔的应用前景。
4、优选地，所述分离寡核苷酸池中单链dna的方法包括：pcr扩增目标核酸序列，获得双链dna溶液，将所述双链dna溶液加到所述固相芯片表面，热变性后紫外光照，获得所述单链dna。
5、在本专利技术中，nhs与dna双链中一条链的5’端氨基结合，实现将双链dna结合到固相芯片表面的作用，通过热变性使dna双螺旋解链，未与nhs结合的dna双链中另一条链脱落，再通过紫外光照使dna单链脱落。
6、优选地，所述双链dna溶液加到所述固相芯片表面后，避光反应1-2h(例如1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h或2h等)。
7、优选地，所述pcr扩增的正向引物5’端修饰有pc氨基，所述pcr扩增的反向引物5’端修饰有荧光基团。
8、本专利技术通过在引物5’端修饰pc氨基，一种独特的胺反应性，可光裂解的化合物基团，使目标序列5’端具有氨基，从而实现与固相芯片上nhs结合的目的。
9、优选地，所述pcr扩增的反向引物5’端修饰有荧光基团。
10、在本专利技术中，反向引物5’端修饰的荧光基团仅做方法验证的表征手段，是否修饰荧光基团以及修饰的荧光基团种类不应视为对本专利技术的限定。
11、优选地，所述荧光基团包括cy3、cy5、fitc、pe、rbitc、tritc、apc、percp、cy5.5或cy7中的任意一种。
12、优选地，所述热变性的温度为94-98℃(例如94℃、95℃、96℃、97℃或98℃等)。
13、优选地，所述热变性的时间为5-15min(例如5min、8min、10min、12min或15min等)。
14、优选地，所述紫外光照的时间为4-30min(例如4min、6min、8min、10min、15min、20min、25min或30min等)。
15、优选地，所述固相芯片的制备方法包括：在芯片原料表面依次进行第一反应、第二反应和第三反应，获得所述固相芯片。
16、优选地，所述第一反应的反应液中含有冰乙酸、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和甲苯，所述冰乙酸、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和甲苯的体积比为(1-5)：(60-100)：(1500-2500)。
17、上述(1-5)中的具体点值可以选择1、2、3、4或5等；上述(60-100)中的具体点值可以选择60、70、80、90或100等；上述(1500-2500)中的具体点值可以选择1500、1800、2000、2200或2500等。
18、优选地，所述第一反应的反应温度为35-45℃(例如35℃、38℃、40℃、42℃或45℃等)，所述第一反应的时间为10-14h(例如10h、11h、12h、13h或14h等)。
19、优选地，所述第一反应后还包括使用乙醇清洗和干燥的步骤。
20、优选地，所述干燥的温度为65-75℃(例如65℃、68℃、70℃、72℃、或75℃等)，所述干燥的时间为1-2h(例如1h、1.3h、1.5h、1.7h或2h等)。
21、优选地，所述第一反应前还包括使用真空等离子仪处理芯片的步骤。
22、优选地，所述第二反应的反应液中含有8-12g/l(例如8g/l、9g/l、10g/l、11g/l或12g/l等)羧甲基纤维素钠和ph为11-13(例如11、11.5、12、12.5或13等)的0.005-0.015mol/l(例如0.005mol/l、0.008mol/l、0.01mol/l、0.012mol/l或0.015mol/l等)磷酸盐缓冲溶液。
23、优选地，所述第二反应的温度为35-45℃(例如35℃、38℃、40℃、42℃或45℃等)，所述第二反应的时间为10-14h(例如10h、11h、12h、13h或14h等)。
24、优选地，所述第二反应后还包括使用水清洗和干燥的步骤。
25、优选地，所述第三反应的反应液中含有0.01-0.03m(例如0.01m、0.015m、0.02m、0.025m或0.03m等)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、0.01-0.03m(例如0.01m、0.015m、0.02m、0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，使用表面修饰有N-羟基丁二酰亚胺的固相芯片分离所述单链DNA。
2.根据权利要求1所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述分离寡核苷酸池中单链DNA的方法包括：PCR扩增目标核酸序列，获得双链DNA溶液，将所述双链DNA溶液加到所述固相芯片表面，热变性后紫外光照，获得所述单链DNA；
3.根据权利要求2所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述PCR扩增的正向引物5’端修饰有PC氨基；
4.根据权利要求2所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述热变性的温度为94-98℃；
5.根据权利要求2所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述紫外光照的时间为4-30min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述固相芯片的制备方法包括：在芯片原料表面依次进行第一反应、第二反应和第三反应，获得所述固相芯片。
7.根据权利要求6所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方
8.根据权利要求6所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述第二反应的反应液中含有8-12g/L羧甲基纤维素钠和pH为11-13的0.005-0.015mol/L磷酸盐缓冲溶液；
9.根据权利要求6所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法，其特征在于，所述第三反应的反应液中含有0.01-0.03M 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、0.01-0.03M 4-二甲氨基吡啶和0.08-0.1M N-羟基丁二酰亚胺；
10.如权利要求1-9任一项所述的分离寡核苷酸池中单链DNA的方法在DNA建库和/或测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种分离寡核苷酸池中单链dna的方法，其特征在于，使用表面修饰有n-羟基丁二酰亚胺的固相芯片分离所述单链dna。
2.根据权利要求1所述的分离寡核苷酸池中单链dna的方法，其特征在于，所述分离寡核苷酸池中单链dna的方法包括：pcr扩增目标核酸序列，获得双链dna溶液，将所述双链dna溶液加到所述固相芯片表面，热变性后紫外光照，获得所述单链dna；
3.根据权利要求2所述的分离寡核苷酸池中单链dna的方法，其特征在于，所述pcr扩增的正向引物5’端修饰有pc氨基；
4.根据权利要求2所述的分离寡核苷酸池中单链dna的方法，其特征在于，所述热变性的温度为94-98℃；
5.根据权利要求2所述的分离寡核苷酸池中单链dna的方法，其特征在于，所述紫外光照的时间为4-30min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离寡核苷酸池中单链dna的方法，其特征在于，所述固相芯片的制备方法包括：在芯片原料表面依次进行第一反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：石芳，陈淑美，蒋涧桥，董一名，
申请(专利权)人：苏州硅基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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