【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst及其应用，更具体的涉及在sod2-mst可作为靶标分子预防与治疗奶牛乳腺炎，开展分子辅助育种的应用。
技术介绍
1、奶牛乳腺炎是影响奶业可持续发展的重要疾病之一，发病的主要原因是病原微生物通过奶牛的乳头导管以及乳房皮肤外伤等进入奶牛的乳腺组织，引起乳腺发生炎症反应。根据临床表现，可将奶牛乳腺炎分为临床乳腺炎和隐性乳腺炎。临床性乳腺炎又分为急性乳腺炎、慢性乳腺炎和恶性乳腺炎。奶牛感染乳腺炎后，最严重的危害是乳腺组织发生炎症病变，引起乳腺部位的损伤，长时间得不到治疗后还会引起乳腺组织的纤维化，从而降低泌乳量，影响乳品质和营养含量。使用患病奶牛产的乳汁制备的乳制品，极易变酸腐败，降低牛乳的利用价值。若不及时治疗乳腺炎，除了会导致乳制品的质量下降之外，还会导致奶牛产奶量的大幅度下降甚至消失，从而导致奶牛提前被淘汰，给奶牛养殖业带来 额外的经济损失。据报道，全球荷斯坦牛群隐性乳腺炎发病率高达48%，我国为25%~70%。隐性乳腺炎不仅严重影响牛奶产量和品质，还会极大增加妊娠牛的流产率和淘汰率，给现代奶业带来严重的经济损失。
2、目前，虽然在奶牛乳腺炎的临床诊断、抗生素治疗和发病机制调控方面取得了一定的进展，但是奶牛乳腺炎发病的分子机制尚不清楚。奶牛乳腺炎作为制约奶牛养殖业发展的主要疾病之一，其受到病原微生物、环境因素以及遗传等因素的影响。其中，表观遗传调控作为一种新的分子调控机制，在奶牛乳腺炎的发生发展过程中扮演着重要的作用。可变剪切作为表观遗传
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst及其应用，该转录本在奶牛乳腺炎组织中的表达显著上调，并且当过表达sod2-mst后，可以显著上调炎症相关因子il6、il8、tnf-α的表达量。而敲低sod2-mst后，炎症因子il6、il8、tnf-α的表达量显著下调。说明sod2-mst能够在奶牛乳腺炎中被诱导表达，且在一定程度上加重炎症反应过程，参与奶牛乳腺炎的发生发展，可作为一种新的奶牛乳腺炎诊断治疗的靶标分子。sod2-mst的发现有助于从分子育种角度为奶牛乳腺炎的预防和治疗提供研究新思路，为奶牛乳腺炎抗病育种策略的制订和靶向治疗药物的研发提供新的指导与依据，具有重要的应用前景。
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、一种奶牛乳腺炎相关的基因特异性转录本sod2-mst，所述奶牛乳腺炎相关的基因特异性转录本sod2-mst的全长序列如seq id no.1所示。
4、所述奶牛乳腺炎相关的基因特异性转录本sod2-mst位于牛的9号染色体上，由sod2基因部分启动子序列及第一、第二、第三、第四外显子和部分第四内含子组成，详见图4中的seq id no.1序列：其中，启动子序列为1-57 nt，第一外显子序列为58-148 nt，第二外显子序列为149-351 nt，第三外显子序列为352-468 nt，第四外显子序列为469-648 nt，第四内含子序列为649-2002 nt。本专利技术还提供上述奶牛乳腺炎相关的sod2-mst在制备检测、预防或治疗奶牛乳腺炎药物、或奶牛乳腺炎抗病育种中的应用。
5、本专利技术还提供上述奶牛乳腺炎相关的sod2-mst制备方法，以奶牛正常乳腺组织total rna为模板，进行sod2-mst的3'端和5'端cdna末端快速扩增。
6、进一步的，3'端和5'端cdna末端快速扩增引物序列如下：seq id no.2、 seq idno.3、seq id no.4和 seq id no.5。
7、本专利技术还提供奶牛乳腺炎相关的sod2-mst的sirna，序列为seq id no.8和9。
8、进一步的，奶牛乳腺上皮组织经原代培养、纯化、传代培养后，得到奶牛原代乳腺上皮细胞。根据得到的sod2-mst全长序列seq id no.1，以pcdna3.1质粒构建sod2-mst过表达载体，并合成相应的下调sod2-mst 表达的sirna。将过表达载体和sirna转染进奶牛原代乳腺上皮细胞，24小时后收集细胞rna，分别得到奶牛乳腺炎相关的sod2-mst过表达和敲低载体，检测sod2-mst及奶牛乳腺炎相关标志因子的表达变化。
9、本专利技术还提供上述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst在制备预防或治疗奶牛乳腺炎药物中的应用。
10、进一步的，所述药物用于下调sod2-mst的表达。
11、进一步的，所述药物用于下调il6、il8、tnf-α的表达。
12、本专利技术还提供上述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst在制备检测奶牛乳腺炎试剂中的应用。
13、进一步的，所述试剂用于检测奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst的表达水平，检测的引物对序列如seq id no.6和7所示。
14、进一步的，炎症相关因子il6、il8、tnf-α的实时荧光定量pcr引物对序列分别为seq id no.10~15所示。
15、优选的是，试剂检测的样本为奶牛正常乳腺组织。
16、优选的是，试剂检测的样本为奶牛正常乳腺组织和炎症型乳腺组织。
17、本专利技术提供了一种sod2-mst的过表达载体和干扰sirna，其序列为seq id no.8和9，检测sod2-mst在奶牛乳腺炎发生发展过程中的功能。
18、优选的是，试剂检测的样本为奶牛原代乳腺上皮细胞。
19、更优选的是，转染sod2-mst的sirna和过表达载体pcdna3.1-sod2-mst到奶牛原代乳腺上皮细胞24小时。
20、有益效果
21、本研究在金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎模型中，筛选鉴定到一个新的乳腺炎相关的基因特异性转录本，其在金葡菌诱导的乳腺炎中显著上调表达，实时荧光定量pcr实验进一步验证该转录本在炎症型乳腺组织中显著上调表达。本专利技术通过race技术克隆出该基因特异性转录本全长序列，基因组比对分析发现，该转录本位于牛的9号染色体上，由sod2基因部分启动子序列及第一、第二、第三、第四外显子和部分第四内含子组成，且与乳腺炎的发生密切相关，因此，命名为sod2-mst（sod2-mastitis specific transcript）。之后，本研究进一步构建了sod2-mst的过表达载体及合成sod2-mst 的sirna干扰序列，转染奶牛原代乳腺上皮细胞，并检测炎症相关因子il6、il8、tnf-α的表达变化，发现过表达sod2-mst可以显著上调炎本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST，其特征在于，所述奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST的全长序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST的制备方法，其特征在于，以奶牛正常乳腺组织Total RNA为模板，进行SOD2-MST的3'端和5'端cDNA末端快速扩增，得到完整的SOD2-MST序列。
3. 根据权利要求2所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST的制备方法，其特征在于，3'端cDNA末端快速扩增引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和 SEQ ID NO.5所示。
4. 根据权利要求2所述奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST的制备方法，其特征在于，5'端cDNA末端快速扩增引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和 SEQ ID NO.5所示。
5. 根据权利要求1所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST的siRNA，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.8
6.权利要求1所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST在制备预防或治疗奶牛乳腺炎药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物用于下调SOD2-MST的表达。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物用于下调IL6、IL8、TNF-α的表达。
9.权利要求1所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST在制备检测奶牛乳腺炎试剂中的应用。
10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂用于检测奶牛乳腺炎相关的特异性转录本SOD2-MST的表达水平，检测的引物对序列如SEQ ID NO.6和7所示。
...【技术特征摘要】
1. 一种奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst，其特征在于，所述奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst的全长序列如seq id no.1所示。
2. 根据权利要求1所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst的制备方法，其特征在于，以奶牛正常乳腺组织total rna为模板，进行sod2-mst的3'端和5'端cdna末端快速扩增，得到完整的sod2-mst序列。
3. 根据权利要求2所述的奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst的制备方法，其特征在于，3'端cdna末端快速扩增引物序列如seq id no.2、seq id no.4和 seq id no.5所示。
4. 根据权利要求2所述奶牛乳腺炎相关的特异性转录本sod2-mst的制备方法，其特征在于，5'端cdna末端快速扩增引物序列如seq id no.3、seq id no.4和...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙雨佳，吴欣苡，杨章平，陆萌萌，张明慧，陈亚丹，李明勋，毛永江，张慧敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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