【技术实现步骤摘要】
本申请为细胞培养，特别地涉及使用微球载体对多巴胺神经前体细胞的分化以及保存的方法。
技术介绍
1、由于中枢神经系统修复能力欠缺，脑卒中、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经退行性疾病一直缺少理想的治疗手段。干细胞具有再生和重建能力,基于干细胞技术的再生医学可以补充缺失的神经细胞，有望为神经系统细胞缺损性疾病的治疗提供新的途径。近年来，大量临床前研究显示人多能干细胞分化的神经细胞脑内移植对啮齿类或非人灵长类神经退行性疾病模型具有良好的治疗效果。目前，神经细胞的分化体系多为2d贴壁体系，移植前消化成单细胞或小细胞团块然后进行移植，主要问题表现在：1)细胞消化使细胞产生应激反应，且会使神经纤维断裂，造成死亡或影响功能；2)移植细胞在体内缺少微环境支持，存活能力差，影响功能；3)2d环境难以实现细胞大批量制备。基于生物微球载体的细胞3d培养技术很好地弥补了以上缺点，主要表现在：1)神经细胞可以在微球载体上进行3d分化，不需要消化而且可以直接冻存，最大程度保持了神经元完整形态，2)在体内实验中，微球载体能够为细胞提供微环境，帮助细胞存活和锚定，以更好的发挥功能；3)微球载体能提供比2d培养皿更大的比表面积，易于实现细胞的大规模培养。
技术实现思路
1、为了解决2d贴壁培养后细胞移植时细胞存活率低的问题本申请提供了：
2、1.一种借助微球载体由多巴胺神经前体细胞分化培养出多巴胺神经元的方法，所述方法包括：
3、通过使多巴胺神经前体细胞贴附于微球载体对
4、其中所述神经前体细胞表达foxa2、lmx1a、otx2和en1，并且不表达tuj1和th，而且未出现神经轴突。
5、2.根据项1所述的方法，其中，所述微球载体由明胶制成，优选所述载体的平均直径分布范围为125-300μm。
6、3.如项1所述的方法，其中，所述多巴胺神经前体细胞是通过将多能干细胞经过14天至20天的贴壁培养，优选经过16天至18天的贴壁培养，最优选经过17天的贴壁培养得到的，其中所使用的培养基是分化培养基，所述分化培养基的配方为：n2培养基+shh(500ng/ml)+ldn(100nm)+sb431542(10μm)+chir99021(0.5-1.0μm)。
7、4.如项2所述的方法，其中，所述多巴胺神经前体细胞在贴附于微球载体之后在搅拌下经历了5天或以上，优选6天以上，最优选7天以上的培养以获得多巴胺神经元。
8、5.如项2所述的方法，其中将所述多巴胺神经前体细胞贴附于所述明胶微球时所使用的接种密度为3×105细胞/mg微球至7×105细胞/mg微球，优选为4×105细胞/mg微球至6×105细胞/mg微球，最优选为5×105细胞/mg微球。
9、6.如项2所述的方法，其中所述微球为3d flotrixtm。
10、7.如项2所述的方法，其中，使所述多巴胺神经前体细胞与所述明胶微球贴附结合时采用延迟搅拌模式，其中所述延迟搅拌模式是指将多巴胺神经前体细胞接种于含有明胶微球的培养基后静置24小时以上，而后使用生物反应器在搅拌下培养，优选以50-70rpm的搅拌速率在生物反应器中培养，最优选在60rpm的搅拌速率在生物反应器中培养。
11、9.如项1所述的方法，其中，使多巴胺神经前体细胞贴附于微球载体以对其进行培养时使用成熟培养基，所述成熟培养基的配方为：b27培养基+bdnf(20ng/ml)+gdnf(20ng/ml)+tgf-β3(1ng/ml)+aa(0.2mm)+db-camp(0.5mm)+dapt(10μm)；其中所述b27培养基的配方为：97％neurobasal-cts+2％b27-supplement+1％glumax-cts。
12、10.如项1至9的任一项所述的方法，其中，在收获多巴胺神经元时，所述多巴胺神经元的回收率为80％以上，优选90％以上，其中所述回收率是指收获时的多巴胺神经元的活细胞数目/接种时的多巴胺神经前体细胞的活细胞数目。
13、11.如项1至9的任一项所述的方法，其中，进一步对多巴胺神经元进行冻存，且经过冻存后复苏的细胞活率为80％-90％，优选83％至89％，最优选活率为86％。
14、12.如项1至11的任一项所述的方法得到的多巴胺神经元。
15、13.含有如项12所述的多巴胺神经元在制备与多巴胺功能缺失的有关的疾病的药物中的用途。
16、14.如项13所述的用途，其中，所述药物用于脑部移植。
17、15.如项14所述的用途，其中，相比于使用2d贴壁培养多巴胺神经前体细胞的脑部移植，所述含有多巴胺神经元的药物的脑部移植具有更低的免疫排斥反应。
18、本申请的技术方案实现的有益技术效果
19、根据本申请的技术方案的明胶载体取得了下述技术效果：(1)支持神经前体细胞在mdap上的贴附；(2)支持神经细胞的分化方向与成熟过程；(3)支持即用型细胞产品的开发，并实现液氮条件下的长期存储；(4)实现不经过消化处理等实验步骤即可完成细胞的注射，维持突触的完整性。
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1.一种借助微球载体由多巴胺神经前体细胞分化培养出多巴胺神经元的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微球载体由明胶制成，优选所述载体的平均直径分布范围为125-300μm。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述多巴胺神经前体细胞是通过将多能干细胞经过14天至20天的贴壁培养，优选经过16天至18天的贴壁培养，最优选经过17天的贴壁培养得到的，其中所使用的培养基是分化培养基，所述分化培养基的配方为：N2培养基+SHH(500ng/ml)+LDN(100nM)+SB431542(10μM)+CHIR99021(0.5-1.0μM)。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述多巴胺神经前体细胞在贴附于微球载体之后在搅拌下经历了5天或以上，优选6天以上，最优选7天以上的培养以获得多巴胺神经元。
5.如权利要求2所述的方法，其中将所述多巴胺神经前体细胞贴附于所述明胶微球时所使用的接种密度为3×105细胞/mg微球至7×105细胞/mg微球，优选为4×105细胞/mg微球至6×105细胞/mg微球，最优选为5×105细
6.如权利要求2所述的方法，其中所述微球为3D FlotrixTM。
7.如权利要求2所述的方法，其中，使所述多巴胺神经前体细胞与所述明胶微球贴附结合时采用延迟搅拌模式，其中所述延迟搅拌模式是指将多巴胺神经前体细胞接种于含有明胶微球的培养基后静置24小时以上，而后使用生物反应器在搅拌下培养，优选以50-70rpm的搅拌速率在生物反应器中培养，最优选在60rpm的搅拌速率在生物反应器中培养。
8.如权利要求1所述的方法，其中，使多巴胺神经前体细胞贴附于微球载体以对其进行培养时使用成熟培养基，所述成熟培养基的配方为：B27培养基+BDNF(20ng/mL)+GDNF(20ng/mL)+TGF-β3(1ng/mL)+AA(0.2mM)+db-cAMP(0.5mM)+DAPT(10μM)；其中所述B27培养基的配方为：97％Neurobasal-CTS+2％B27-supplement+1％Glumax-CTS。
9.如权利要求1至8的任一项所述的方法，其中，在收获多巴胺神经元时，所述多巴胺神经元的回收率为80％以上，优选90％以上，其中所述回收率是指收获时的多巴胺神经元的活细胞数目/接种时的多巴胺神经前体细胞的活细胞数目。
10.如权利要求1至8的任一项所述的方法，其中，进一步对多巴胺神经元进行冻存，且经过冻存后复苏的细胞活率为80％-90％，优选83％至89％，最优选活率为86％。
11.如权利要求1至10的任一项所述的方法得到的多巴胺神经元。
12.含有如权利要求11所述的多巴胺神经元在制备与多巴胺功能缺失的有关的疾病的药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述药物用于脑部移植。
14.如权利要求13所述的用途，其中，相比于使用2D贴壁培养多巴胺神经前体细胞的脑部移植，所述含有多巴胺神经元的药物的脑部移植具有更低的免疫排斥反应。
...【技术特征摘要】
1.一种借助微球载体由多巴胺神经前体细胞分化培养出多巴胺神经元的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微球载体由明胶制成，优选所述载体的平均直径分布范围为125-300μm。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述多巴胺神经前体细胞是通过将多能干细胞经过14天至20天的贴壁培养，优选经过16天至18天的贴壁培养，最优选经过17天的贴壁培养得到的，其中所使用的培养基是分化培养基，所述分化培养基的配方为：n2培养基+shh(500ng/ml)+ldn(100nm)+sb431542(10μm)+chir99021(0.5-1.0μm)。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述多巴胺神经前体细胞在贴附于微球载体之后在搅拌下经历了5天或以上，优选6天以上，最优选7天以上的培养以获得多巴胺神经元。
5.如权利要求2所述的方法，其中将所述多巴胺神经前体细胞贴附于所述明胶微球时所使用的接种密度为3×105细胞/mg微球至7×105细胞/mg微球，优选为4×105细胞/mg微球至6×105细胞/mg微球，最优选为5×105细胞/mg微球。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述微球为3d flotrixtm。
7.如权利要求2所述的方法，其中，使所述多巴胺神经前体细胞与所述明胶微球贴附结合时采用延迟搅拌模式，其中所述延迟搅拌模式是指将多巴胺神经前体细胞接种于含有明胶微球的培养基后静置24小时以上，而后使用生物反应器在搅拌下培养，优选以50-70r...
【专利技术属性】
技术研发人员：周琪，李伟，胡宝洋，王昱凯，郝捷，冯琳，王柳，李达，田瑶，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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