【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于生产l-半胱氨酸的方法，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自o-乙酰基-l-丝氨酸巯基酶(oas巯基酶，ec 4.2.99.8)类别的酶转化o-乙酰基-l-丝氨酸(oas)。作为该生物转化的结果，提供l-半胱氨酸。
技术介绍
1、l-半胱氨酸可以例如用于鱼类养殖(nakamura et al.，fisheries science(2021)87：353-363)或化妆品行业(us 4053630)，例如作为-slim(dsm)的成分用于皮肤护理。在肽化学中，l-半胱氨酸被用作水溶性保护基团。此外，l-半胱氨酸可以通过脱羧转化为牛磺酸。
2、l-半胱氨酸((r)-2-氨基-3-磺丙酸，3-磺基-l-丙氨酸，cas 498-40-8)可以化学生产，例如通过用氯在醇溶液中氧化半胱氨酸(tao et al.amino acids(2004)27：149-151)，用溴在hcl中或碘hcl在dmso中，或通过用过甲酸氧化裂解胱氨酸。此外，l-半胱氨酸也可以通过l-半胱氨酸亚磺酸的氧化来生产。用于化学生产l-半胱氨酸的已知方法，不被认为是可持续的，使用环境有害的化学品并且具有低的消费者接受度，尤其是在食品、化妆品和药物领域的应用中。因此，需要更环境友好且更可持续的生产方法，其中一种选择是生物技术方法。
3、l-半胱氨酸是非蛋白原性l-氨基酸，其可以在自然界中被检测为蛋白原性氨基酸l-半胱氨酸的氧化产物，例如在羊毛中。半胱氨酸也是产甲烷古细菌生物合成辅酶m(com，2-巯基乙磺酸，cas 33
4、现有技术提供了用于生产非蛋白原氨基酸的方法，例如通过具有失调的半胱氨酸代谢的微生物的直接发酵(ep 1191106 b1)或通过oas巯基酶催化的oas的生物转化(ep1247869 b1)。这些方法是基于oas巯基酶，其催化oas与亲核体的反应，根据通式(1)以形成非蛋白原氨基酸：
5、(1)oas+亲核体->非蛋白氨基酸+乙酸盐
6、在例如大肠杆菌的半胱氨酸代谢中，oas充当l-半胱氨酸的生物合成前体。后者是通过硫醇基取代β位置处的乙酸酯基团形成的。这种反应，称为β-取代，由oas巯基酶(ec4.2.99.8)类的酶催化。因此，oas是oas巯基酶反应的实际底物(也称为反应物)，并且亲核试剂是可变的共底物。
7、在ep 1 247 869 b1中，测试了多种不同亲核体作为与oas的oas巯基酶-催化的(例如，cysm-催化的)反应的亲核体的适合性，包括硒化物、硒醇、叠氮化物、氰化物、唑和异噁唑烷酮。此外，测试了来自通式h-s-r的硫代硫酸盐和硫醇的组的硫化合物，基团r是单价的取代或未取代的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基基团。
8、产生的是非蛋白氨基酸，如s-苯基-l-半胱氨酸，它们在自然界中不用作蛋白质生物合成的构建单元。所披露的亲核体均不允许产生l-半胱氨酸。
9、joo et al.(2018)，j.agric.food chem.66：13454–13463描述了一种用于在细菌谷氨酸棒状杆菌中生产牛磺酸的代谢工程化方法。在菌株中异源表达l-半胱氨酸合酶、半胱氨酸双加氧酶和l-半胱氨酸亚磺酸脱羧酶的基因以实现牛磺酸的产生。joo et al.(2018)，j.agric food chem.66：13454–13463的图2描述了牛磺酸的各种代谢途径，这些还包括途径(“l-半胱氨酸磺酸途径”)，该途径起始于o-磷酸-l-丝氨酸并且经由l-半胱氨酸导致牛磺酸并且原则上也将适合于生产l-半胱氨酸。然而，该图还显示不存在已知的从oas至l-半胱氨酸，仅至l-半胱氨酸的生物合成途径。
10、tevatia et al.，algal research(2015)9：21-26，描述了在微藻中牛磺酸的天然生产，其中l-半胱氨酸也被检测为中间体。如图1a)中描述的，tevatia et al.，algalresearch(2015)9：21-26的生物合成途径导致从l-丝氨酸至l-半胱氨酸(图1a中的“半胱氨酸酸酯”)。所描述的生物合成途径中没有经由oas产生l-半胱氨酸。在微藻中检测到的l-半胱氨酸的细胞内含量非常低并且伴随有多种副产物，这些副产物使得加工过程更困难，如甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸亚磺酸、次黄牛磺酸和牛磺酸，并且因此微藻的生长不适合于生产l-半胱氨酸。
11、在代谢工程方法中，us2019/0062757 a1(knipbio)描述了用于生产牛磺酸的异源生产菌株，所述菌株还旨在适用于生产l-半胱氨酸。us 2019/0062757a1的图4-9和12描述了牛磺酸的各种生物合成途径，其含有l-半胱氨酸作为中间体，因此原则上适于生产l-半胱氨酸。这些生物合成途径中均没有起始于oas。此外，仅报告了低牛磺酸和牛磺酸产率，并且它们非常低，最高为419ng/ml。没有提到用于生产l-半胱氨酸的产率。必须假定l-半胱氨酸不能达到更高的产率。因此，这种代谢工程方法不适于l-半胱氨酸的生物技术生产。
12、因此，现有技术仅公开了化学方法且没有公开适于工业用途的用于产生l-半胱氨酸的经济上可行的生物技术方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供用于通过生物转化生产l-半胱氨酸的生物技术方法。
2、该目的通过一种生产l-半胱氨酸的方法实现，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自o-乙酰基-l-丝氨酸巯基酶(oas巯基酶，ec 4.2.99.8)类别的酶转化o-乙酰基-l-丝氨酸(oas)。该方法提供通过生物转化产生的l-半胱氨酸。
3、根据本专利技术的方法的优点是它是用于生产l-半胱氨酸的可持续且技术上可行的生物转化方法。可以省去对环境有害的化学品。不消耗化石原材料，并且没有产生有毒的化学废物和/或废气。因此，本专利技术的生产方法是环境友好的和可持续的。此外，该方法不需要极端的反应条件或特殊的设备并且因此易于技术上实施。该方法的另一个优点是可以通过这种方式生产需求日益增长的天然l-半胱氨酸。
4、已经出人意料地发现，亚硫酸的盐(在下文中称为亚硫酸盐或so32-)在反应(1)中适合作为亲核体并且允许根据等式(2)在迄今未知的反应中合成l-半胱氨酸。
5、(2)oas+so32-->l-半胱氨酸+乙酸盐
6、在本专利技术的上下文中，生产方法区分如下：
7、1.化学工艺
8、2.生物技术方法：
9、a)通过代谢工程
10、与生物转化相反，代谢工程(也称为“途径设计”)是通过优化或修饰遗传和调节过程来修饰生物的代谢途径的生物技术方法。新的或修饰的酶可以通过用酶的基因补充基因组而被引入生物体中，或内源酶的基因可以以增强的或减弱的水平表达，由此在生物体中建立新的代谢途径或增强或减弱现有的代谢途径。代谢工程化的目的是生物体以增加的产率产生新的代谢物或细胞内源性代谢物。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生产L-半胱氨酸的方法，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自O-乙酰基-L-丝氨酸巯基酶(OAS巯基酶，EC 4.2.99.8)类别的酶转化O-乙酰基-L-丝氨酸(OAS)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述OAS巯基酶是细菌酶。
3.根据权利要求1和2中一项或两项所述的方法，其特征在于，所述OAS巯基酶是来自大肠杆菌菌株的CysM。
4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述OAS巯基酶源自发酵生产。
5.根据权利要求1至4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述OAS巯基酶借助于非GMO的微生物发酵生产。
6.根据权利要求1至5中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述OAS巯基酶借助于大肠杆菌菌株DH5α/pFL145发酵生产。
7.根据权利要求1至6中一项或多项所述的方法，其特征在于，OAS源自发酵生产。
8.根据权利要求1至7中一项或多项所述的方法，其特征在于，OAS借助于非GMO的微生物发酵生产。
9.根据权利要求1至8中一项或
10.根据权利要求1至9中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法是天然生产方法。
11.根据权利要求1至10中一项或多项所述的方法，其特征在于，所使用的亚硫酸的盐是Na2SO3、K2SO3、(NH4)2SO3、NaHSO3(或其酸酐Na2S2O5)或KHSO3。
12.根据权利要求1至11中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述亚硫酸盐的浓度至少是与OAS等摩尔浓度。
13.根据权利要求1至12中一项或多项所述的方法，其特征在于，反应在至少5.5且小于7.5的pH下进行。
14.根据权利要求1至13中的一项或多项所述的方法，其特征在于，基于所使用的OAS的摩尔量，L-半胱氨酸的摩尔产率是至少60％。
15.根据权利要求1至14中一项或多项所述的方法，其特征在于，从反应批料中富集L-半胱氨酸。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于生产l-半胱氨酸的方法，其中在亚硫酸盐的存在下，使用至少一种选自o-乙酰基-l-丝氨酸巯基酶(oas巯基酶，ec 4.2.99.8)类别的酶转化o-乙酰基-l-丝氨酸(oas)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述oas巯基酶是细菌酶。
3.根据权利要求1和2中一项或两项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶是来自大肠杆菌菌株的cysm。
4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶源自发酵生产。
5.根据权利要求1至4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶借助于非gmo的微生物发酵生产。
6.根据权利要求1至5中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述oas巯基酶借助于大肠杆菌菌株dh5α/pfl145发酵生产。
7.根据权利要求1至6中一项或多项所述的方法，其特征在于，oas源自发酵生产。
8.根据权利要求1至7中一项或多项所述的方法，其特征在于，oas借助于非gmo的微生物发酵生产...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁珀特·普法勒，托马斯·施勒泽尔，京特·维希，
申请(专利权)人：瓦克化学股份公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。