本发明专利技术提供了CRY1(CRYPTOCHROME 1)基因在负调控植物内质网应激耐受性中的应用，所述CRY1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述负调控表现在过表达CRY1基因的植物对内质网应激耐受性降低，而降低CRY1基因表达的植物对内质网应激耐受性提高，所以本发明专利技术提供了一种新的提高植物内质网应激耐受性的方法，可以通过减少目的植物中CRY1基因的表达或者减少目的植物中CRY1蛋白的活性来提高植物对内质网应激的耐受性，为植物的分子育种和遗传改造提供了一种新的基因资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及
cry1基因在负调控植物内质网应激耐受性中的应用。
技术介绍
1、内质网 (er) 应激反应是许多真核生物中常见的一种重要应激反应。内质网应激可由生物和非生物因素诱导，如病原体感染、内质网应激、高盐度、损伤和内质网应激诱导剂，并导致内质网中错误折叠蛋白的积累和内质网中未折叠蛋白的积累。为了减轻内质网应激，蛋白折叠伴侣和内质网相关蛋白降解机制的水平增加，这被称为未折叠蛋白反应。在这一过程中，不同的膜相关转录因子会将应激信号传递到细胞核中，并上调编码内质网蛋白质折叠机制组分的基因，包括腔内结合蛋白 (bip)、钙调蛋白 (cnx) 等，这些蛋白会帮助清除折叠错误的蛋白。在动物和植物细胞中，当未折叠蛋白反应无法应对内质网应激时，就会诱发程序性细胞死亡。
2、
cryptochrome(
cry) 是一种黄素型蓝光光感受器，在目前的报道中cry1在调节蓝光抑制下胚轴伸长方面起着重要作用，而cry2主要在低强度蓝光下抑制胚轴生长。crys在结构上分为一个与光解酶相关的n端区域和一个c端延伸区域。目前的研究已经证明，拟南芥cry1蛋白的c端区域cct1和cry2蛋白的c端区域cct2都具有光敏特性，都参与了对光的响应。目前为止，尚未有研究表明
cry1基因与植物对内质网应激的耐受性有关联。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供
cry1基因在负调控植物内质网应激耐受性中的应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案概述如下：
3、基于拟南芥tair官网 (https://www.arabidopsis.org/) 公布的拟南芥全基因组测序，获得拟南芥
cry1基因 (即at4g08920) 的核苷酸序列信息。
cry1基因编码框核苷酸序列长度为2046 bp，由681个氨基酸组成，其序列可以通过拟南芥tair官网查询获得。
4、本专利技术还构建一系列植物表达和敲除载体，含有上述基因的表达载体、基因编辑载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物内质网应激耐受性方面的功能也落入本专利技术的保护范围之内。
5、本专利技术所保护的基因的功能，不仅包括上述
cry1基因，还包括与
cry1基因具有较高同源性 (如同源性高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％) 的同源基因在内质网应激耐受性方面的功能。
6、本专利技术根据
cry1的cds基因序列构建了35s启动的pcambia1300过表达载体和ec1.2p启动子的phec401基因编辑载体，通过农杆菌侵染分别获得了
cry1过表达株系和
cry1敲除突变株系，分析了
cry1过表达株系和
cry1突变体 (
cry1敲除突变株系) 在苗期内质网应激胁迫中的生物学功能，从而为作物抗逆分子育种提供基因资源。
7、本专利技术公开的
cry1基因在植物耐内质网应激中的生物学功能，具体表现在：在内质网应激胁迫下，
cry1敲除突变株系对内质网应激的耐受性显著高于野生型；而
cry1过表达株系对内质网应激的耐受性低于野生型。上述应用通过内质网应激处理实验得出结论。
8、根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐内质网应激的植株，具体地，可以通过敲除
cry1基因，得到转基因植物，该植株对内质网应激的耐受性高于目的植物。
9、具体地，可通过所述基因编辑载体导入所述目的植物。所述方法中，所述基因编辑载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
10、为了提高植物的优良性状，本专利技术还保护一种新的植物育种方法，包括如下步骤(1) 或(2)：
11、(1) 通过减少目的植物中
cry1蛋白的活性，获得内质网应激耐受性强于目的植物的植株；
12、(2) 通过降低目的植物中
cry1基因的表达，获得内质网应激耐受性强于目的植物的植株；
13、“降低目的植物中
cry1基因的表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：
14、(1) 在目的植物中敲除
cry1基因；
15、(2) 插入t-dna序列使基因无法表达；
16、(3) 本领域内的其它常见方法。
17、其中，本专利技术所述目的植物是拟南芥。
18、另外，为了进一步探究cry1调控内质网应激的机制，对cry1的互作蛋白进行了鉴定，通过免疫沉淀串联质谱分析实验 ，分析鉴定到在内质网应激下可能与cry1特异性结合的蛋白，并且挑选了几个得分较高的蛋白 (其中得分最高蛋白为bip1)，将它们和 cry1 的全长编码序列同yfp的n端以及c端序列构建融合载体。利用构建好的载体进行双分子荧光互补实验 (bifc)，将它们两两组合共同转化入拟南芥原生质体，之后利用激光共聚焦显微镜对原生质体进行观察，结果显示只有转化了
psat4a-cry1-ce和
psat4a-bip1-ne的原生质体出现了黄色荧光信号，并且转化了
psat4a-cry1-ce和 ne 或者ce和
psat4a-bip1-ne的原生质体中均未出现重构的黄色荧光，说明黄色荧光的出现是由cry1和 bip1 的互作产生，而不是由自激活导致，得出cry1能够与bip1在体内发生互作。
19、所以，本专利技术不仅发现了cry1会负调控植物对内质网应激的耐受性，还找到了可能的原因，即通过影响bip1基因的蛋白功能来调节植物对内质网应激的适应。实验表明，bip1 蛋白本身具有提高植物内质网应激耐受性的功能，并且当cry1存在时，cry1与bip1结合，限制了bip1蛋白参与内质网应激反应，因此，当植物体内cr本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.CRY1基因在负调控植物内质网应激耐受性中的应用，其特征在于，所述CRY1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述负调控表现在过表达CRY1基因的植物对内质网应激耐受性降低，而降低CRY1基因表达的植物对内质网应激耐受性提高，所述植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述内质网应激耐受性表现为植物对衣霉素的耐受性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，降低CRY1基因表达的方式为敲除CRY1基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，敲除CRY1基因的方式是通过构建CRY1 Crispr-cas9基因编辑载体，获得CRY1基因敲除突变株系，所述突变株系的内质网应激耐受性高于野生型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以野生型拟南芥为出发植株，将构建出的基因编辑载体导入农杆菌中，通过农杆菌侵染拟南芥花序，并通过抗性筛选获得CRY1基因敲除突变株系。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CRY1基因为拟南芥来源的CRY1基因。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，CRY1蛋白能够与BIP1蛋白在体内发生互作， 所述BIP1 蛋白能够提高植物的内质网应激耐受性。
8.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下 (1) 或 (2)：
9.根据权利要求8所述的植物育种方法，其特征在于，降低目的植物中CRY1基因表达的方法为敲除CRY1基因。
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【技术特征摘要】
1.cry1基因在负调控植物内质网应激耐受性中的应用，其特征在于，所述cry1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述负调控表现在过表达cry1基因的植物对内质网应激耐受性降低，而降低cry1基因表达的植物对内质网应激耐受性提高，所述植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述内质网应激耐受性表现为植物对衣霉素的耐受性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，降低cry1基因表达的方式为敲除cry1基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，敲除cry1基因的方式是通过构建cry1 crispr-cas9基因编辑载体，获得cry1基因敲除突变株系，所述突变株系的内质网应激耐受性...
【专利技术属性】
技术研发人员：李志远，宁昕，徐秀美，吕丹丹，陈立超，孙扬，石艳云，王珂，张立新，
申请(专利权)人：河南大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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