【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，特别是一种增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
1、目前防治病原体感染的最有效措施之一是接种疫苗。临床使用疫苗多采用肌肉、皮下注射，这种传统免疫方式能够诱导系统性免疫应答，但无法激活足够的黏膜免疫应答，因而不具有黏膜防御能力。相较而言，口服疫苗能够很好地激活肠道黏膜免疫应答，并促进黏膜分泌保护性免疫球蛋白a（iga）抗体，在建立黏膜免疫记忆和效应方面比注射疫苗更有效，因而能够有效预防黏膜病原体的感染。更重要的是，口服疫苗因其给药方便、依从性好、交叉污染风险低、经济效益高等特点表现出了独特的优势。
2、口服黏膜疫苗的研发正处于如火如荼的向上阶段，面临着相当大的科学挑战，如胃肠道复杂的生物环境易导致抗原失活、缺乏优秀的黏膜免疫佐剂等，视黄酸被认为是一种有效且安全的黏膜疫苗佐剂，可促进黏膜组织中iga抗体的产生，粪产碱杆菌属于肠道派尔集合淋巴结的共生菌，而目前并没有将负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒表面包被粪产碱杆菌细胞壁以完成纳米疫苗的构建的相关报道。
技术实现思路
1、针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法及其应用，可有效解决传统注射型疫苗依从性差、黏膜免疫反应低的问题。
2、本专利技术解决的技术方案是，该增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗是通过化学法提取粪产碱杆菌细胞壁，利用去溶剂化法制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒，之后使用机械挤压法在纳米粒表面包被上
3、1）制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒
4、称取0.5-1.5mg视黄酸溶解于0.5-1.5ml无水乙醇中，称取25-40mg抗原蛋白溶解于5-8ml无菌水中，将上述溶液混合后，加入10-20μl戊二醛作为交联剂，在室温下避光搅拌反应12-24h，反应结束后用离心机8000r/min离心10min，沉淀，即为负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒；
5、2）制备粪产碱杆菌细胞壁碎片
6、将粪产碱杆菌接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在37℃培养箱中进行需氧培养，将活菌5000r/min离心5min分离出菌体，控制菌密度为1×107-1×108cfu/ml，向该菌悬液中分别加入氢氧化钠、十二烷基硫酸钠和碳酸钙，使其终浓度分别为5-6mg/ml、1.5-2mg/ml、0.4-1μg/ml，上述混合溶液在37℃孵育1-2h，6000r/min离心10min后收集沉淀，洗涤后重悬于无菌水中，得重悬液，向上述重悬液中加入30%过氧化氢溶液，使其终浓度为4%-4.5%，得混合液，上述混合液继续于37℃下孵育15-25min，6000r/min离心10min，收集沉淀，将沉淀用组织研磨仪研磨破碎，即得粪产碱杆菌细胞壁碎片；
7、3）制备增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗
8、将步骤1）制备的负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒15-35mg和步骤2）制备的粪产碱杆菌细胞壁碎片20-40mg混合后重悬于4-5ml无菌水中，得混悬液，将该混悬液先后用含孔径为0.8μm和0.4μm聚碳酸酯膜的脂质体挤出仪来回挤压各4-6次，收集混悬液在14000r/min离心20min，沉淀，即为增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗。
9、所述的抗原蛋白为卵清蛋白、乙型肝炎表面抗原、沙门氏菌o-抗原的一种。
10、所述的胰蛋白胨大豆肉汤培养基组成为：胰蛋白胨17.0 g/l、大豆蛋白胨3.0 g/l、氯化钠5.0 g/l、磷酸氢二钾2.5 g/l、葡萄糖2.5 g/l，ph值7.3±0.2。
11、所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗在制备预防或治疗肠道黏膜病原体感染的药物中的应用。
12、所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗在制备干粉、片剂或者胶囊剂中的应用。
13、本专利技术制备条件温和，工艺简单，方法稳定可靠，生产费用低，制备的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗可以促进免疫球蛋白a的产生，有效激发肠道黏膜免疫应答，预防黏膜病原体的感染，拓开了肠道黏膜免疫的新思路，是增强肠道黏膜免疫疫苗上的创新，经济和社会效益巨大。
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1. 一种增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，该增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗是通过化学法提取粪产碱杆菌细胞壁，利用去溶剂化法制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒，之后使用机械挤压法在纳米粒表面包被上粪产碱杆菌细胞壁，即得粒径为150-250nm的口服纳米疫苗，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述的抗原蛋白为卵清蛋白、乙型肝炎表面抗原、沙门氏菌O-抗原的一种。
3. 根据权利要求1所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述的胰蛋白胨大豆肉汤培养基组成为：胰蛋白胨17.0 g/L、大豆蛋白胨3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L，PH值7.3±0.2。
4. 根据权利要求2所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
5. 根据权利要求2所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
6. 根据权利要求2所述的增强
7.权利要求1-6任一项所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗在制备预防或治疗肠道黏膜病原体感染的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1. 一种增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，该增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗是通过化学法提取粪产碱杆菌细胞壁，利用去溶剂化法制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒，之后使用机械挤压法在纳米粒表面包被上粪产碱杆菌细胞壁，即得粒径为150-250nm的口服纳米疫苗，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述的抗原蛋白为卵清蛋白、乙型肝炎表面抗原、沙门氏菌o-抗原的一种。
3. 根据权利要求1所述的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述的胰蛋白胨大豆肉汤培养基组成为：胰蛋白胨17...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯倩华，姚雨琪，刘佳，王晴，赵晓雯，朱昱翠，张文文，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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