【技术实现步骤摘要】
本申请涉及药物分析及生物检验，尤其是涉及一种采用高效液相色谱法检测疫苗产品中蔗糖含量的方法以及应用。
技术介绍
1、蔗糖是自然界分布最广的非还原性二糖，由一分子葡萄糖和一分子果糖缩合失去一分子水而构成，具有旋光性，但无变旋现象。在酸或蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成等量的d-葡萄糖和d-果糖，其化学结构式为：
2、
3、注射剂的无菌和内有害物质等负荷，企业应考虑对所加入的工艺相关杂质进行有效去除。因此，对蔗糖进行质量控制，对于研究疫苗产品的质量、工艺的稳定性有比较重要的意义。
4、早期实验室对糖进行分析的方法主要为薄层色谱法、纸色谱法和柱层析法等经典方法，这些方法分辨率差、难进行定量测定并且分析时间长无法对大量样品进行测定。
5、目前，疫苗中蔗糖含量的检测方法主要为比旋度法、离子色谱-积分脉冲安培检测法和高效液相色谱-示差折光检测法。比旋度法通过测定溶液中的比旋度来确定蔗糖含量，这种测定方法受制备溶液的影响较大，度数精度较低。离子色谱积分脉冲安培检测时，该方法检测快速准确，灵敏度高。但是其色谱柱价格昂贵，且色谱柱和流动相管路要进行较多的维护不利于实验室日常检测效率的提高。高效液相色谱-示差折光检测法测量蔗糖含量，目前使用较多的是氨基色谱柱，并均以乙腈-水为流动相，然而，这种方法容易导致基线噪音大，平衡时间长。尽管该方法操作简便、精密度较高，相对于早期经典的方法更安全高效，但氨基色谱柱的寿命较短，灵敏度较差，不适用于微量产品的检验。经常更换色谱柱会影响检测的稳定性，并增加蔗糖含量检测的成
技术实现思路
1、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种直接、快速、准确、成本较低的检测疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，本申请提供一种采用高效液相色谱法检测疫苗产品中蔗糖含量的方法以及应用。
2、第一方面，本申请提供一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，包括如下色谱条件：
3、色谱柱：采用氢型磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为填充剂；
4、色谱柱的柱温为26～30℃；
5、色谱柱的规格为300mm*8.0mm，6μm；
6、流动相：采用硫酸水溶液，所述硫酸水溶液的浓度为0.01～0.03mol/l；流动相的流速为0.5～0.7ml/min；
7、样品的进样量为10～20μl；
8、样品室温度为20～30℃；
9、检测器：采用示差折光检测器为检测器；所述示差折光检测器的检测温度为20～25℃。
10、通过采用上述技术方案，本申请提供的用于检测疫苗中蔗糖含量的高效液相色谱法，采用氢型磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物作为填充剂的色谱柱，并结合示差折光检测器，能够快速、准确地测定疫苗中蔗糖的含量。使用该方法，样品的前处理相对简单，线性范围广且定量限低而灵敏，而且能够直接测定多种糖类。
11、首先，本申请所选用的氢型磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色谱柱对于各种类型的单糖、二糖和多糖的分析具有较好的耐用性和重现性，本申请使用的色谱柱与硅胶基质的氨基柱相比对各种类型的单糖、二糖及多糖的分析具有更好的耐用性和重现性，其色谱柱内添加的磺化剂使色谱柱的强阳离子的交换作用得到明显提升。氢型磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色谱柱能够结合尺寸排阻法和离子排斥法分离糖类、有机酸类物质，可实现糖类和有机酸的同时分析。
12、本申请中，需要检验的疫苗样品为流感病毒裂解疫苗中间产品，由于，在检测流感病毒裂解疫苗中蔗糖含量时，需要用到的物料为蔗糖、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等物质，由于氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠统作为pbs溶液，pbs溶液在示差折光检测下和蔗糖相互干扰，使两种物质的出峰时间基本一致，故不能检测出蔗糖的真实结果，因此，本申请为了解决检测蔗糖含量时出现的，检测精确度较差的问题，在本申请中采用了孔径为6μm的氢型磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色谱柱，并且通过控制流动相的流速和浓度，有效的提高了蔗糖含量的检测精确度。
13、本申请还提供了流动相的浓度对于蔗糖与其他干扰物质的分离程度的影响，同时，提供了流动相的流速、样品的进样量和色谱柱的柱温对待测样品保留时间和分离度的影响。本申请提供的流速范围、样品的进样量和色谱柱的柱温，均能够确保高效液相色谱图中目标物的出峰时间适宜、峰形良好、各峰之间的分离度好，从而保证检测结果的真实性和可靠性。
14、本申请提供的方法具有操作简单、重现性好、精密度高、灵敏度高和检测限低等优点。
15、柱温箱是高效液相色谱仪中的一个重要组件，它用于控制色谱柱的温度，以提高分离效果和稳定性。本申请通过设置较低的温度，能够有效地减少背景噪音、增强信号峰、改善分离效果，并延长色谱柱的寿命。
16、另外，本申请使用的色谱柱的耐酸性较强，能够耐受低ph值的流动相。这种优势使得柱子在强酸性条件下仍然能够保持良好的分离性能，而不会发生退化或损坏。对于阳离子交换柱而言，它们相比普通阳离子交换柱具有更强的交换作用。这意味着它们能更有效地吸附和洗脱样品中的阳离子成分，从而实现更好的洗脱效果和更快的出峰时间。这种性能优势大大缩短了检测时间，提高了检测效率。
17、总的来说，柱温箱的使用能够提高高效液相色谱的分离效果和稳定性，而耐酸性强的色谱柱以及具有强交换作用的阳离子交换柱则能够实现更好的洗脱效果和更快的出峰时间，进一步提高分析效率。
18、本申请选用的示差折光检测器与折光仪相比，在对流感病毒裂解疫苗进行蔗糖含量的检测时，示差折光检测器对氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等物质干扰程度更小，测出的结果更准确。而折光仪测量的蔗糖浓度(％)最小分度值为0.25，即2500μg/ml，其测量的最小分度值远高于质控标准，因此，会导致测量样品中的值为未检出，进而无法测出其准确数值。因此，本申请采用差折光检测器能够进一步提高检测精确度。
19、此外，在本领域中液相耐受的最低ph值为1.0，而本申请为了保证检测精确度，在本申请中使用浓度相对较高的高浓度硫酸(浓度为0.02mol/l，ph为1.5～1.7)作为流动相，进一步提高了检测精确度。
20、总之，本申请使用浓度为0.02mol/l的硫酸作为流动相，将高浓度硫酸作为流动相，小流速冲洗系统，可有效提高各色谱峰之间的分离度，有利于指导疫苗生产中对蔗糖的日常检测，从而保证产品质量。
21、可选的，所述检测方法还包括供试品溶液的制备，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
22、s1、将疫苗原液稀释，制得稀释后的样品；
23、s2、将稀释后的样品与沉淀剂按体积比1：(2～5)混匀，放置1～4h、离心，离心速度为3000～4000g/min、离心时间为10～15min，取上清液，作为供试品溶液；
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述方法为高效液相色谱法，包括如下色谱条件：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括供试品溶液的制备，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括蔗糖对照品溶液，所述蔗糖对照品溶液的制备方法为如下：称取蔗糖对照品50mg，用超纯水定容至10ml，制得浓度为5mg/ml的蔗糖对照品贮备液；将蔗糖对照品贮备液浓度稀释至1~1000μg/ml，制得所述蔗糖对照品溶液。
4.根据权利要求2所述一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述疫苗原液包括四价流感病毒裂解疫苗、流感病毒裂解疫苗 。
5.根据权利要求1所述的一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中稀释后的疫苗原液，使用的稀释剂选自PBS缓冲液；所述PBS缓冲液包括重量比为9.8：1：14.4的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠以及氯化钠；所述PBS缓冲液中，磷酸根的浓度为0.02mol/L，PBS缓冲液的pH为7.4。
6.根据权利要求1所述的一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Dikma CarboPac H+色谱柱。
7.根据权利要求1所述的一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为28℃。
8.根据权利要求1所述的一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.6 ml/min。
9.根据权利要求1所述的一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述示差折光检测器的检测温度为25℃。
10.根据权利要求1所述一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述硫酸水溶液的浓度为0.02 mol/L。
...【技术特征摘要】
1.一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述方法为高效液相色谱法，包括如下色谱条件：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括供试品溶液的制备，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括蔗糖对照品溶液，所述蔗糖对照品溶液的制备方法为如下：称取蔗糖对照品50mg，用超纯水定容至10ml，制得浓度为5mg/ml的蔗糖对照品贮备液；将蔗糖对照品贮备液浓度稀释至1~1000μg/ml，制得所述蔗糖对照品溶液。
4.根据权利要求2所述一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述疫苗原液包括四价流感病毒裂解疫苗、流感病毒裂解疫苗 。
5.根据权利要求1所述的一种疫苗产品中蔗糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中稀释后的疫苗原液，使用的稀释...
【专利技术属性】
技术研发人员：于艳，申依函，任克达，张显昱，温立丽，宫宝成，闫秀琦，张丹阳，许春香，王伟，张启明，
申请(专利权)人：成大生物本溪有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。