【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然产物提取分离领域，具体涉及一种瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法。
技术介绍
1、瓜蒂中的葫芦素类化合物因具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒及保肝等多种生理活性得到了研究人员的持续关注。值得注意的是，多种葫芦素类化合物显示了优异的细胞毒活性，展示了良好的抗肿瘤药物开发潜力。目前已上市的葫芦素片(成分为总葫芦素)对原发性肝癌有较好的辅助治疗作用。与此同时，单体化合物葫芦素b、e、d等对乳腺癌、结肠癌、肝癌以及肺癌等肿瘤细胞均有着微摩尔甚至纳摩尔级别的细胞毒活性。通过对具有抗肿瘤活性的葫芦素类化合物进行构效分析，研究人员发现葫芦素类化合物侧链的α,β-不饱和酮结构对于保持化合物的抗肿瘤活性至关重要，任何对该结构的变动都会导致活性下降甚至丧失。而如果能够对瓜蒂中含有α，β不饱和酮结构的活性葫芦素进行快速分离，将进一步提升人们对瓜蒂这一传统中药的开发和利用水平。
2、目前，研究人员在含α，β不饱和羰基结构天然产物的快速发现领域获得了较大进展。利用α，β不饱和羰基结构亲电且易于发生迈克尔加成反应的特性，研究人员开发了含有巯基、卤原子以及紫外吸收基团的药效团探针(图1)。探针通过与含α，β不饱和基团天然产物发生加成反应，影响化合物的液相(出峰时间和紫外吸收改变)和质谱表现(分子量改变)，从而实现对于含有α，β不饱和羰基结构天然产物的快速发现。
3、遗憾的是，该类药效团探针的设计运用局限于含α，β不饱和基团活性天然产物的快速识别。在发现目标化合物后，研究人员需要利用多种手段对其进行分离纯化，而药用植物
技术实现思路
1、本专利技术的目的是利用迈克尔加成反应的可逆性，开发建立含α，β不饱和基团天然产物的定向富集方法，对中药瓜蒂中活性葫芦素类化合物进行快速富集。本专利技术建立的含α，β不饱和羰基结构活性天然产物的定向富集新方法，对于瓜蒂中该类化合物的快速提取分离具有重要意义。同时，对该方法进行完善后，可推广到各类传统中药以及药用植物中含α，β不饱和基团活性化合物的提取分离工作中，具有较大的应用空间。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、参照图2所示，一种瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，包括如下步骤：
4、1)将原料瓜蒂粉碎，用95％乙醇回流提取并减压浓缩至无醇味得总浸膏。随后用乙酸乙酯萃取并减压浓缩，得总葫芦素浸膏。
5、2)将总葫芦素浸膏溶解于乙腈中，加入半胱氨酸，并在三乙胺催化下进行迈克尔加成反应。
6、3)反应结束后减压浓缩，随后加入乙酸乙酯和酸水进行萃取。取酸水层加入碳酸钠将ph调为碱性，加入过量碘乙酸促进迈克尔加成逆反应的进行，即含α，β不饱和基团葫芦素和半胱氨酸的解离。
7、4)向碱水层中加入乙酸乙酯萃取游离的含α，β不饱和基团葫芦素并减压浓缩，完成对于该类化合物的定向富集。
8、具体的，步骤1)所述的95％乙醇的加入量为瓜蒂药材重量的7-8倍，回流时间为2小时，提取次数为三次。
9、步骤2)中，半胱氨酸的加入量为总葫芦素浸膏重量的0.2-0.4倍。所加入的半胱氨酸量应确保能与浸膏中含α，β不饱和基团葫芦素进行彻底反应。半胱氨酸加入量优选为总葫芦素浸膏重量的0.3倍。同时，三乙胺的加入是为了有利于迈克尔加成反应的顺利进行，加入量与半胱氨酸物质的量相等。半胱氨酸和浸膏中含α，β不饱和基团葫芦素反应所需时间为两小时。
10、步骤3)中，酸水为乙酸水溶液，浓度为0.2m。加入量为三乙胺物质的量的两倍。加入酸水是为了抑制迈克尔加成逆反应的进行使得从与半胱氨酸加合物中部分解离的含α，β不饱和基团葫芦素因为被乙酸乙酯萃取而导致目标化合物富集率的降低。由于含α，β不饱和基团葫芦素和半胱氨酸偶联，使得化合物极性大大增加，化合物由脂溶性转变为水溶性，因此可以溶解于酸水中，从而与非目标产物有效分离。
11、步骤3)中，碳酸钠加入后使得最终的ph在9-10之间。将酸水调碱的目的是有利于后续迈克尔加成逆反应的进行。碘乙酸的加入量为半胱氨酸物质的量的2-4倍。碘乙酸能够和半胱氨酸发生亲核取代反应，可通过竞争性的消耗半胱氨酸促进含α，β不饱和基团葫芦素与半胱氨酸加合物的解离。所加入量优选为半胱氨酸物质量的3倍。该反应所需时间为4小时。
12、步骤4)中由于含α，β不饱和基团葫芦素和半胱氨酸的加合物解离，使得目标化合物由水溶性重新变为脂溶性。因此可以使用乙酸乙酯进行萃取富集，和水溶性的半胱氨酸、碘乙酸以及半胱氨酸和碘乙酸的加成产物分离，从而完成对该类化合物的定向富集。
13、本专利技术的优点在于：工艺过程简单，操作简便，且导向性高，能够将提取物中含α，β不饱和基团葫芦素进行高效的富集，有利于后续活性葫芦素单体的分离。
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1.一种瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
2.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤1)中，95％乙醇的加入量为瓜蒂重量的7-8倍，回流时间为2小时，提取次数为三次。
3.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤2)中，半胱氨酸的加入量为总葫芦素浸膏重量的0.2-0.4倍。
4.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤2)中，三乙胺的加入量与半胱氨酸物质的量相等，反应时间为两小时。
5.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤2)中，酸水为浓度为0.2M的乙酸水溶液，加入量为三乙胺物质的量的两倍。
6.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤2)中，碳酸钠加入后使得最终的PH在9-10之间。
7.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在
8.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于步骤2)中，解离反应所需时间为4小时。
...【技术特征摘要】
1.一种瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
2.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤1)中，95％乙醇的加入量为瓜蒂重量的7-8倍，回流时间为2小时，提取次数为三次。
3.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤2)中，半胱氨酸的加入量为总葫芦素浸膏重量的0.2-0.4倍。
4.如权利要求1所述的瓜蒂中含α，β不饱和基团葫芦素的定向富集方法，其特征在于，步骤2)中，三乙胺的加入量与半胱氨酸物质的量相等，反应时间为两小时。
【专利技术属性】
技术研发人员：朱天宇，胡良勇，胡航，徐德锋，骈元欣，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：
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