【技术实现步骤摘要】
本专利技术凝血酶活性检测，具体涉及一种基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法。
技术介绍
1、凝血酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，通常存在于血液中。它能将可溶性纤维蛋白原水解为不溶性纤维蛋白，从而参与血液凝固过程。此外，凝血酶在炎症反应和血管组织修复等各种生理过程中也有重要作用。正常情况下，凝血酶以酶原的形式存在于体内。一旦发生创伤，酶原就会被激活，从而产生高达微摩尔水平的凝血酶来执行止血功能。体内凝血酶水平升高会导致血栓性或出血性疾病，包括心血管疾病、动脉粥样硬化、炎症和阿尔茨海默病。此外，凝血酶还可作为一种治疗剂控制术中患者的出血。因此，开发一种简单、快速、经济、高效的凝血酶活性检测方法至关重要。
2、目前已报道了多种检测凝血酶活性的方法，包括比色法、荧光法和电化学法。与传统的免疫测定法相比，这些方法更准确、灵敏度更高、稳定性更好。然而，上述凝血酶测定方法分析时间较长，且需要标记分子、复杂的仪器和专业操作人员，这可能会限制其在不同领域的实际应用。例如，电化学方法检测灵敏度高，但需要标记分子，而光谱方法容易受到其他物质的干扰。因此，开发一种无标记、经济、简单的凝血酶活性检测方法是非常必要的。
3、目前，反应迅速、灵敏度高、成本低的生物传感器被广泛应用于分析检测领域。例如，han等人设计了一种基于纸的横向流动传感器，利用纤维蛋白原向纤维蛋白的转化来快速检测凝血酶，纤维蛋白的转化会调节溶液的粘度。在条件优化后，只需20.0ul样品，检测过程可在3.0分钟内完成，凝血酶的检测限为16.1mu/ml。然而，所报道的
4、床旁检测(poct)是一种成本低、反应快、操作简便的快速检测技术，其开发目的是简化检测过程，就近为患者服务。在各种poct方法中，个人血糖仪是最成功的生物传感平台，这不仅是因为它便于携带、价格低廉、检测简单、结果可靠，还因为它在全球范围内广受欢迎。迄今为止，个人血糖仪已被广泛用于检测以下疾病非葡萄糖分析物，包括生物硫醇、甲胎蛋白、多菌灵、心肌肌钙蛋白i和酶活性。大多数已报道的非葡萄糖分析物特异性检测方法都是通过使用标记或无标记酶进行酶催化反应来实现个人血糖仪信号检测的。然而，这种方法的主要缺点是制备步骤复杂、反应时间长、分析灵敏度低。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对上述存在的技术问题，提供一种基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，将用于目标识别和信号转导的凝血酶反应性纤维蛋白原与便携式个人血糖仪定量信号读出技术相结合来实现，具有高度的选择性和准确性。
2、有鉴于此，本专利技术提供一种基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于，按照如下方法检测：
3、(1)标准样品的准备：将纤维蛋白原加入氯化钠溶液中，在上述溶液中加入蔗糖酶；将凝血酶溶于去离子水中制备初始活力值为114u/ml凝血酶溶液，经过稀释得到不同活力值的凝血酶储备液，将不同活力值的凝血酶储备液加入到含蔗糖酶的纤维蛋白原溶液中孵育；孵育完成后，加入去离子水，并对混合物进行涡旋，加入蔗糖溶液，再次孵育；
4、(2)再次孵育完成后，取溶液用于血糖仪分析，获得不同活性凝血酶所对应的血糖仪读数值，建立标准曲线；
5、(3)样品处理：将血清样品稀释后，加入到含蔗糖酶的纤维蛋白原溶液中，孵育；孵育完成后，加入去离子水，并对混合物进行涡旋，加入蔗糖溶液，再次孵育完成后取溶液用血糖仪进行检测，得出血清样品凝血酶活性。
6、上述方案中：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，纤维蛋白原的终浓度为2.5-10mg/ml，第一次孵育时间为5min，孵育温度40℃。
7、上述方案中：氯化钠溶液的初始浓度为10mg/ml。
8、上述方案中：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，蔗糖酶的终浓度为0.25-1.25mg/ml，蔗糖的终浓度为2.5-12.5mg/ml，再次孵育的温度为40-80℃，孵育时间3-5min。
9、上述方案中：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，蔗糖酶的终浓度为1.0mg/ml，蔗糖的终浓度为7.5mg/ml，再次孵育的温度为50℃，孵育时间5min。
10、上述方案中：凝血酶的最终活力值选择0u/ml、0.285u/ml、0.518u/ml、0.57u/ml、0.777u/ml、0.829u/ml。凝血酶的最终活力值指测试液中的最终活力值。
11、上述方案中：步骤(3)中，血清样品的稀释倍数为1000倍。
12、本专利技术研究开发了一种基于个人血糖仪的快速检测凝血酶活性的方法。凝血酶的检测使用的是纤维蛋白原，检测原理是受血液凝固过程的启发，凝血酶水解纤维蛋白原产生纤维蛋白水凝胶，包裹在纤维蛋白水凝胶中的蔗糖酶的量随样品溶液中凝血酶的活性而波动，定量检测是通过测量可用于水解底物蔗糖的未包封蔗糖酶的数量来进行的，信号读数使用个人血糖仪记录。具体地，通过将用于目标识别和信号转导的凝血酶反应性纤维蛋白原与便携式个人血糖仪定量信号读出技术相结合来实现的。纤维蛋白原不仅能识别凝血酶，还能作为纤维蛋白水凝胶的构件包裹大量蔗糖酶用于信号传导和放大。在凝血酶的作用下，纤维蛋白原会水解形成包裹大量蔗糖酶的纤维蛋白水凝胶。然后，未被包裹的蔗糖酶则催化蔗糖产生葡萄糖，葡萄糖用个人血糖仪定量测量。
13、基于个人血糖仪传感平台，凝血酶的线性检测范围为0-0.8u/ml，检测限为0.04u/ml。选择性和干扰实验结果表明，本专利技术开发的个人血糖仪传感平台对凝血酶活性具有高度的选择性和准确性。最后，通过测定回收率，考察了便携式血糖仪快速检测血清样品中凝血酶的可靠性。本专利技术建立的方法无需对纳米材料或试剂进行改性或处理，准确性更高。此外，该方法避免了使用大型仪器、生物大分子的标记处理和专业人员，整个检测过程只需要纤维蛋白原、酶试剂和葡萄糖试纸。线性范围更广，灵敏度好。
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1.一种基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于，按照如下方法检测：
2.根据权利要求1所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，纤维蛋白原的终浓度为2.5-10mg/ml，第一次孵育时间为5min，孵育温度40℃。
3.根据权利要求1或2所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：氯化钠溶液的初始浓度为10mg/ml。
4.根据权利要求3所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，蔗糖酶的终浓度为0.25-1.25mg/ml；蔗糖的终浓度为2.5-12.5mg/ml，再次孵育的温度为40-80℃，孵育时间3-5min。
5.根据权利要求4所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，蔗糖酶的终浓度为1.0mg/ml；蔗糖的终浓度为7.5mg/ml，再次孵育的温度为50℃，孵育时间5min。
6.根据权利要求5所述基于便携式血糖仪快速检
7.根据权利要求6所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：步骤(3)中，血清样品的稀释倍数为1000倍。
...【技术特征摘要】
1.一种基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于，按照如下方法检测：
2.根据权利要求1所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，纤维蛋白原的终浓度为2.5-10mg/ml，第一次孵育时间为5min，孵育温度40℃。
3.根据权利要求1或2所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：氯化钠溶液的初始浓度为10mg/ml。
4.根据权利要求3所述基于便携式血糖仪快速检测凝血酶活性的方法，其特征在于：在蔗糖酶、纤维蛋白原的氯化钠混合溶液中，蔗糖酶的终浓度为0.25-1.25mg/ml；蔗糖的终浓度为2.5-12.5mg/ml，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张浩，杨丹妮，邓晗宇，
申请(专利权)人：重庆医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：
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