【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种发酵生产l-高丝氨酸的工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、l-高丝氨酸(l-homoserine，2-amino-4-hydroxybutyric acid)是甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸的前体，参与体内多种生理生化反应和多个生物代谢过程，具有重要的生理功能和应用价值。l-高丝氨酸还是一种重要的平台化合物，作为原料或中间体合成多种化工产品，广泛应用于食品、化妆品、医药和饲料等领域。目前大部分市售草铵膦是d和l型混合物，但只有l-草铵膦具有除草活性。l-高丝氨酸可用于合成l-草铵膦，减少除草剂的用量和成本，减少对土壤和作物的危害。因此，l-高丝氨酸用来合成新型农药l-草胺磷，具有广阔的市场前景。
2、目前，l-高丝氨酸的合成方法主要是化学法和生物酶法。化学法采用相对昂贵的l-蛋氨酸为原料，使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，并且生成硫化物，对环境造成污染。生物酶法是以丙酮酸和醛类化合物为原料，在醛缩酶、甲酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的共同催化下反应得到高丝氨酸，还需要使用有毒原料(甲醛和甲酸)和昂贵的辅酶。微生物发酵法具有成本低、条件温和以及环境污染少等许多优点，是生产各类氨基酸的首选工艺。
3、目前发酵法生产l-高丝氨酸的代谢工程改造策略，主要包括强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thra或lysc、l-天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd、丙酮酸羧化酶基因pyc或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc等。敲除高丝氨酸降解代谢途径基因thrb后，工程菌为苏氨酸和异
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种发酵生产l-高丝氨酸的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。该工程菌可以降低l-高丝氨酸发酵过程中营养缺陷型氨基酸——苏氨酸的用量，从而可以降低发酵成本，具有重要的工业应用价值。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种发酵生产l-高丝氨酸的工程菌的构建方法，包括以大肠杆菌为出发菌株，导入表达thra突变基因的表达载体、过表达ppc基因的表达载体和过表达asd基因的表达载体，全部或部分敲除thrb基因、tdh基因、ltae基因和tdcb基因，构建得到所述工程菌的步骤；
4、所述thra突变基因的核苷酸序列是将seq id no.1所示核苷酸序列的1297-1299bp处的碱基突变为编码精氨酸的碱基而得到；
5、所述ppc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、所述asd基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；
7、所述thrb基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；
8、所述tdh基因的核苷酸序列如seq id no.20所示；
9、所述ltae基因的核苷酸序列如seq id no.31所示；
10、所述tdcb基因的核苷酸序列如seq id no.42所示。
11、进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌k12 mg1655。
12、本专利技术还提供一种根据上述的构建方法构建得到的发酵生产l-高丝氨酸的工程菌。
13、本专利技术还提供上述的工程菌在发酵生产l-高丝氨酸中的应用。
14、本专利技术还提供一种发酵生产l-高丝氨酸的方法，包括利用上述的工程菌发酵生产l-高丝氨酸的步骤。
15、本专利技术还提供一种降低l-高丝氨酸发酵过程中苏氨酸用量的方法，包括利用上述的工程菌发酵生产l-高丝氨酸的步骤。
16、进一步地，所述发酵生产使用的发酵培养基包括以下组分：葡萄糖20.0g/l、硫酸铵15.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、七水硫酸镁2.0g/l、酵母粉2.0g/l、玉米浆2.0g/l、苏氨酸0.3g/l、feso4·7h2o 0.05g/l和mnso4·4h2o 0.05g/l；
17、所述发酵生产中补料使用的葡萄糖储液包括以下组分：600g/l葡萄糖和12g/l苏氨酸。
18、本专利技术公开了以下技术效果：
19、本专利技术通过全部或部分敲除大肠杆菌ilva之外的苏氨酸降解途径基因tdcb、ltae和/或tdh构建得到了发酵生产l-高丝氨酸的工程菌。这种工程菌可以降低l-高丝氨酸发酵过程中营养缺陷型氨基酸——苏氨酸的用量，从而可以降低发酵成本，具有重要的工业应用价值。
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1.一种发酵生产L-高丝氨酸的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以大肠杆菌为出发菌株，导入表达thrA突变基因的表达载体、过表达ppc基因的表达载体和过表达asd基因的表达载体，全部或部分敲除thrB基因、tdh基因、ltaE基因和tdcB基因，构建得到所述工程菌的步骤；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌K12MG1655。
3.一种根据权利要求1或2所述的构建方法构建得到的发酵生产L-高丝氨酸的工程菌。
4.一种如权利要求3所述的工程菌在发酵生产L-高丝氨酸中的应用。
5.一种发酵生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，包括利用权利要求3所述的工程菌发酵生产L-高丝氨酸的步骤。
6.一种降低L-高丝氨酸发酵过程中苏氨酸用量的方法，其特征在于，包括利用权利要求3所述的工程菌发酵生产L-高丝氨酸的步骤。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述发酵生产使用的发酵培养基包括以下组分：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母
...【技术特征摘要】
1.一种发酵生产l-高丝氨酸的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以大肠杆菌为出发菌株，导入表达thra突变基因的表达载体、过表达ppc基因的表达载体和过表达asd基因的表达载体，全部或部分敲除thrb基因、tdh基因、ltae基因和tdcb基因，构建得到所述工程菌的步骤；
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌k12mg1655。
3.一种根据权利要求1或2所述的构建方法构建得到的发酵生产l-高丝氨酸的工程菌。
4.一种如权利要求3所述的工程菌在发酵生产l-高丝氨酸中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王志敏，郭玉峰，张天宇，桂铅，
申请(专利权)人：杭州精构生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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