【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物菌种保藏，尤其涉及一种嗜盐菌菌种保护剂及其应用。
技术介绍
1、菌种保藏主要是指通过降低细胞新陈代谢速度，使细胞生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的。菌种保藏有助于减少菌种更新需求，降低实验生产成本。普通微生物的菌种保藏方法有斜面保藏法、液体石蜡油保藏法、沙土保藏法(适合产孢菌种)、-80℃低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法等。其中，在低温条件下保藏菌种一般需要加入相应的保护剂，以减少极端环境对菌体的伤害。
2、目前市面上的保护剂种类较多，常见的有脱脂乳类保护剂和复合保护剂。其中，脱脂乳类保护剂是利用蛋白质和糖等成分在水体系中形成稳定胶体结构，进而在菌体周围形成蛋白质分子保护层，发挥阻止菌体聚合及保护菌体的作用。脱脂乳类保护剂通常能满足大部分菌种的保藏需求。复合保护剂通常会结合待保藏菌种自身特点，将多种原料成分如交联剂、增稠剂、抑菌剂、甘油、酪蛋白、小分子多糖等复配得到。在特定菌种的保藏中，复合保护剂通常能发挥相较更好的保护效果。
3、嗜盐细菌是指只有在含盐的环境才能生长的微生物，按最适宜生长所需的盐量，分为中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。中度嗜盐菌指在含盐浓度为3％～15％的环境中能良好生长的微生物，极端嗜盐菌是指在含盐浓度为15％～30％的介质中也能良好生长的微生物，最适宜生长浓度为20％～25％，甚至在饱和浓度中也能生长。有研究表明，真空冷冻干燥法搭配传统脱脂乳类保护剂用于保藏部分嗜盐菌，保藏一年后的存活率不足25％。因此，真空冷冻干燥法搭配传统脱脂乳类保护剂
4、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种适合嗜盐菌菌种保藏的保护剂及其应用。
2、具体的，本专利技术的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了一种嗜盐菌菌种保护剂，所述嗜盐菌菌种保护剂包含海藻糖脂、渗透压调节剂、增稠剂和水；海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为0.5-5％。
4、本专利技术尝试寻找新的适合嗜盐菌菌种保藏的保护剂，尤其是一种基于敲除部分外膜的嗜盐菌的菌种保藏用保护剂。用以降低低温保存过程中菌种的死亡率，结果意外地发现海藻糖脂对嗜盐菌的低温保存具有良好保护效果：当海藻糖脂浓度为0.5-5wt％时，其对嗜盐菌进行低温冻存一年后的菌种存活率可提高20％左右，对敲除部分外膜的嗜盐菌进行低温冻存一年后的菌种存活率可提高30％以上。
5、在本专利技术中，海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为0.5％，1.0％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％，3.5％，4.0％，4.5％，5.0％，或者以上任意两个数值组成的数值区间内的值。优选地，海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为2.5-3％。该区间范围得到的嗜盐菌菌种保护剂对菌种的保存效果相较更好。
6、在本专利技术中，所述嗜盐菌菌种保护剂包含渗透压调节剂。
7、优选地，所述渗透压调节剂选自无机盐。其中，所述无机盐可选自无机钠盐和/或无机钾盐。例如，本专利技术所述的无机盐可以包括但不限于氯化钠和/或柠檬酸钠；也可以用钾盐替代，如氯化钾和/或柠檬酸钾等；或者是其中钠盐与钾盐的任意组合。本专利技术通过添加渗透压调节剂，调节保护剂中的离子浓度，有助于保证嗜盐菌菌体细胞内外渗透压平衡，并能维持ph的相对稳定，更适于嗜盐菌生存。
8、优选地，所述渗透压调节剂和所述海藻糖脂的质量比为0.5-10:0.5-5。
9、进一步优选地，所述渗透压调节剂选自氯盐和/或柠檬酸盐；当所述渗透压调节剂中含有氯盐时，所述氯盐和所述海藻糖脂的质量比为2-10:0.5-5；当所述渗透压调节剂中含有柠檬酸盐时，所述柠檬酸盐和所述海藻糖脂的质量比为0.5-2.5:0.5-5。
10、在本专利技术中，所述嗜盐菌菌种保护剂包含增稠剂。
11、添加增稠剂有助于更好地分散菌株细胞，提高海藻糖脂的保护效果。
12、在本专利技术中，所述增稠剂和所述海藻糖脂的质量比优选为5-30:0.5-5。
13、进一步优选地，所述增稠剂选自甘油和/或脱脂乳粉；当所述增稠剂中含有甘油时，所述甘油和所述海藻糖脂的质量比为10-30:0.5-5；当所述增稠剂中含有脱脂乳粉时，所述脱脂乳粉和所述海藻糖脂的质量比为5-15:0.5-5。
14、在本专利技术提供的其中一种较为具体的实施方式中，所述嗜盐菌菌种保护剂为冻存保护剂(由液体直接在低温环境下冻存，不同于真空冷冻干燥保藏)。
15、所述冻存保护剂优选包含10-30％的甘油，2-10％的氯化钠和/或氯化钾，0.5-2.5％的柠檬酸钠和/或柠檬酸钾，0.5-5％的海藻糖脂。
16、更优选地，所述冻存保护剂包含15±1％的甘油，3±0.5％的氯化钠，1.0±0.5％的柠檬酸钠和0.5-5％的海藻糖脂。
17、经验证，本专利技术提供的冻存保护剂对嗜盐菌进行-80℃低温冻存一年后的菌种存活率在88％以上，存活率可提高20％左右；对敲除部分外膜的嗜盐菌进行-80℃低温保存一年后的菌种存活率达80％，存活率可提高30％以上。
18、在本专利技术提供的另一种较为具体的实施方式中，所述嗜盐菌菌种保护剂为冻干保护剂。
19、所述冻干保护剂优选包含5-15％的脱脂乳粉，2-10％的氯化钠和/或氯化钾，0.5-2.5％的柠檬酸钠和/或柠檬酸钾，0.5-5％的海藻糖脂。
20、更优选地，所述冻干保护剂包含10±1％的脱脂乳粉，3.0±1％的氯化钠，1.0±0.5％的柠檬酸钠和0.5-5％的海藻糖脂。
21、经验证，本专利技术提供的冻干保护剂对嗜盐菌进行冻干-20℃保存一年后的菌种存活率在70％以上，存活率可提高25％；对敲除部分外膜的嗜盐菌进行冻干-20℃保存一年后的菌种存活率在60％左右，存活率可提高50％以上。
22、本专利技术提供的嗜盐菌菌种保护剂适于嗜盐菌的菌种保存，尤其适于敲除部分外膜的嗜盐菌。
23、本专利技术对敲除外膜的具体手段不作特别限定，本领域常规方法(例如公开文献“ziyu wang et al.,2021.engineering the permeability of halomonasbluephagenesis enhanced its chassis properties”记载的敲除外膜方法)均可。
24、在本专利技术中，所述敲除部分外膜的嗜盐菌是指敲除嗜盐菌基因组中与外膜脂多糖合成和修饰相关的基因，获得的外膜缺陷型菌株。故其自身抗逆性较差，对抗生素、温度、ph更加敏感，外膜通透性更强，细胞壁更容易破碎，故在极端环境中更难维持细胞的完整性，较常规嗜盐菌的保藏难度更高。本专利技术提供的嗜盐菌菌种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述嗜盐菌菌种保护剂包含海藻糖脂、渗透压调节剂、增稠剂和水；海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为0.5-5％。
2.根据权利要求1所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述渗透压调节剂和所述海藻糖脂的质量比为0.5-10:0.5-5，所述渗透压调节剂选自无机钠盐和/或无机钾盐。
3.根据权利要求1或2所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述增稠剂和所述海藻糖脂的质量比为5-30:0.5-5，所述增稠剂选自甘油和/或脱脂乳粉。
4.根据权利要求1-3任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为2.5-3％。
5.根据权利要求1-4任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述渗透压调节剂选自氯盐和/或柠檬酸盐；当所述渗透压调节剂中含有氯盐时，所述氯盐和所述海藻糖脂的质量比为2-10:0.5-5；当所述渗透压调节剂中含有柠檬酸盐时，所述柠檬酸盐和所述海藻糖脂的质量比为0.5-2.5:0.5-5。
6.根据权利要求1-5任意一项所述嗜盐菌
7.根据权利要求1-5任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述嗜盐菌菌种保护剂为冻干保护剂，其包含5-15％的脱脂乳粉，2-10％的氯化钠和/或氯化钾，0.5-2.5％的柠檬酸钠和/或柠檬酸钾，0.5-5％的海藻糖脂。
8.根据权利要求1-7任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述嗜盐菌为敲除部分外膜的嗜盐菌。
9.权利要求1-8任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂在嗜盐菌保存中的应用，所述应用包括如下方式(1)或(2)：
10.嗜盐菌菌剂，其特征在于，包含嗜盐菌，还包含权利要求1-8任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂；
...【技术特征摘要】
1.嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述嗜盐菌菌种保护剂包含海藻糖脂、渗透压调节剂、增稠剂和水；海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为0.5-5％。
2.根据权利要求1所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述渗透压调节剂和所述海藻糖脂的质量比为0.5-10:0.5-5，所述渗透压调节剂选自无机钠盐和/或无机钾盐。
3.根据权利要求1或2所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述增稠剂和所述海藻糖脂的质量比为5-30:0.5-5，所述增稠剂选自甘油和/或脱脂乳粉。
4.根据权利要求1-3任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述海藻糖脂在所述嗜盐菌菌种保护剂中的质量百分浓度为2.5-3％。
5.根据权利要求1-4任意一项所述嗜盐菌菌种保护剂，其特征在于，所述渗透压调节剂选自氯盐和/或柠檬酸盐；当所述渗透压调节剂中含有氯盐时，所述氯盐和所述海藻糖脂的质量比为2-10:0.5-5；当所述渗透压调节剂中含有柠檬酸盐时，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘威，徐明琴，崔鑫楠，杜开心，高特，
申请(专利权)人：北京微构工场生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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