【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物安全领域，特别涉及一种高效包装减毒hiv-1病毒的方法。
技术介绍
1、免疫治疗近年来经历了一系列突飞猛进的发展过程。由于在临床研究中疗效显著,特异性过继免疫细胞疗法已成为学界和业界关注的焦点。在治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤方面效果显著，car-t细胞免疫疗法已成为国内外研究的热点。通常在car-t细胞的生产中使用逆转录病毒或慢病毒载体,将car基因有效地引入t细胞。但是,使用这些病毒载体也会导致rcr或rcl污染的风险。对于复制型慢病毒(rcl)的检测来说，可以采用hiv弱毒株或重组的条件复制型慢病毒载体作为阳性对照病毒。若以hiv弱毒株为阳性对照病毒，其感染试验所涉及的培养应在p3级生物安全实验室条件下进行。每次检测实验都需要阳性对照组别，因此阳性对照病毒是复制型慢病毒(rcl)检测中的关键材料。
2、hiv病毒基因组由两条正义链的rna组成，编码了9种蛋白，包括gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。三个最大的阅读框gag、pol和env，编码了三个最主要的结构蛋白。vif、vpu、vpr和nef编码四个辅助蛋白，缺失后不会影响病毒的复制能力。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高效包装减毒hiv-1病毒的方法，该方法在hek293t细胞中瞬时转染减毒hiv-1(r8.71)质粒，培养后收取细胞上清液，并采用超滤管对病毒进行浓缩，一步法得到高滴度的减毒hiv-1(r8.71)，具有包装简单、时间短、
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种高效包装减毒hiv-1病毒的方法，该方法包括以下步骤：
4、s1、细胞准备
5、准备用于转染的293t细胞；
6、s2、转染
7、2.1准备：dmem培养基、fbs和pbs放置于室温或37℃水浴锅内解冻预热；
8、2.2转染前换液：取出上述一步培养的293t细胞，当细胞密度60％-80％时，吸去培养瓶中的上清液，更换15-20ml含有2％fbs的dmem培养基，放37℃，5％co2培养箱中待用；
9、2.3质粒稀释：转染体系1ml/瓶，吸取总体积1/2-2/3至无血清dmem培养基50ml离心管中，标记为“质粒管”，剩余体积标记为“pei管”；
10、吸取hiv-1pr8.71质粒加入到装有无血清dmem培养基的质粒管中，混匀；2.4pei稀释：取出提前配制的15ug/ml的pei溶液，使用无血清dmem培养基进行5倍稀释，根据上一步加入质粒总体积的3-4倍体积吸取pei溶液至“pei管”中，混匀；
11、2.5将稀释后的“pei管”中液体滴加至“质粒管”中，混匀后静置，孵育15-20min；
12、转染：将孵育好的转染体系按照1ml/瓶，滴加至培养瓶中，混匀，放入37℃，5％co2培养箱培养；
13、s3、补液与收获
14、3.1补液：转染后24-30h，取出培养箱中的培养瓶，向培养瓶中加入15-20ml含有2％fbs的dmem培养基；
15、3.2收获：转染后50-54h，取出培养箱中的培养瓶吸取全部上清液至无菌离心管中；s4、浓缩与分装
16、除菌过滤、浓缩、分装和储存，得到减毒hiv-1(r8.71)病毒。
17、作为优选，s1、细胞准备具体是：
18、1.1.pbs清洗：准备293t细胞，当细胞密度90％-100％时进行传代操作；用3-5mlph7.2-7.410mmpbs缓冲液洗涤细胞；
19、1.2胰酶消化：加入2-5ml0.25％胰酶进行消化，待细胞消化后，经1300rpm离心3min，弃上清，加入5mlph7.2-7.410mmpbs缓冲液重悬细胞，重复离心，弃上清，得到细胞悬液；
20、控制传代比例为1:3-6；
21、1.3分装：向培养瓶中加入15-17ml含有10％fbs的dmem培养基，将上述细胞悬液量按照1ml/瓶加入到培养瓶中；
22、1.4培养：37℃，5％co2培养箱培养24-48h。
23、作为优选，2.3质粒稀释中，质粒浓度按照3μg/t25，9-10μg/t75，21μg/t175的基准添加。
24、作为优选，s4、浓缩与分装具体是：
25、4.1除菌过滤：将上述收获的上清液经0.22μm滤膜过滤至无菌离心管中；
26、4.2浓缩：将过滤后的上清液分装入15ml100kd或300kd超滤管，于离心机4000-5500rpm，4℃离心10-15分钟，重复离心至最终浓缩体积；
27、4.3分装和储存，得到减毒hiv-1(r8.71)病毒。
28、根据病毒粒子直径保证病毒回收率和一定的纯度需用100kd或300kd超滤管。
29、本专利技术的有益效果是：
30、本专利技术通过基因工程学技术将hiv-1的vif、vpu、vpr和nef四个辅助基因删除，保留其他所有元件，构建到真核表达载体上，得到减毒hiv-1(r8.71)质粒。随后在真核细胞中进行包装，培养后收取细胞上清液，并采用超滤管对病毒进行浓缩，得到纯化的减毒hiv-1(r8.71)。
31、所包装病毒完全具有自我复制能力，能够作为rcl检测的阳性对照病毒，且方法简单、高效。
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1.一种高效包装减毒HIV-1病毒的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S1、细胞准备具体是：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：2.3质粒稀释中，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S4、浓缩与分装具体是：
【技术特征摘要】
1.一种高效包装减毒hiv-1病毒的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：s1、细胞准备具体是：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，胡孟军，钟伟超，方兴建，卢孔鑫，毛馨悦，江琦，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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