【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于casp4构建的模拟als疾病的模型及方法。
技术介绍
1、随着精准医疗的需求，为疾病研究和新药筛选提供可靠的人源化动物模型，已成为近年来实验动物模型领域的热点和难点。tdp-43 (transactive response dna-bindingprotein 43，tardbp) 是一种多功能的dna和rna结合蛋白，对细胞核中rna转录、选择性剪接、mrna稳定性调节等过程发挥重要作用。但在肌萎缩侧索硬化症als患者脑中，tdp-43蛋白会从神经细胞核异常转移到细胞质中并聚集，成为此病的重要标志物和致病机制。即不仅表现为内源性tdp-43在细胞核中正常功能的丧失（loss of function）；而且在细胞质中，tdp-43与其它功能蛋白的异常互作，也发挥了获得性神经毒性的功能（gain offunction），在als疾病中，当脑中“丧失性功能”和“获得性功能”积累到一定程度，病人出现中枢神经上、下运动神经元的退化和死亡，从而导致肌肉萎缩，最终大脑逐渐丧失支配运动的能力。
2、因此，若能建立一种可模拟脑中tdp-43从细胞核向细胞质病理性转移的实验小鼠，将对治疗和研究als疾病至关重要。但是迄今为止，尚无任何一种小鼠模型可同时展示tdp-43在细胞核中丢失和细胞质中聚集的疾病特征。原因在于目前所有tdp-43转基因啮齿类动物模型中，tdp-43将会以全长形式仅累积在小鼠神经细胞核中（shan, x.(2010).altered distributions of gemin
3、半胱天冬酶caspase-4（casp4）是一种仅在人和猴等高等动物中表达的水解酶，病理状态下casp4的水解可发挥对包括pro-il18在内的多种底物蛋白的剪切，而小鼠的同源类似物casp11则无法实现这些剪切作用(xuyan shi . (2023).recognition andmaturation of il-18 by caspase-4 noncanonical inflammasome. nature.）（pascaldevant. (2023). structural insights into cytokine cleavage by inflammatorycaspase-4. nature.)。
4、因此，若能建立条件性敲入casp4基因的小鼠模型，可更精准地实现将小鼠中的内源性tdp-43蛋白从细胞核异位到细胞质，将有利于更好的利用小鼠资源研究als疾病，也避免了因过表达tdp-43或其碎片产物时，基因拷贝数过高的弊端。但目前没有任何一种casp4敲入小鼠模型的存在，原因在于caspase-4作为炎症性caspase家族亚类成员，多项研究表明，caspase-4的瞬时表达会导致多种细胞系的凋亡发生(hitomi, j, (2004).involvement of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosisand abeta-induced cell death. j. cell biol.）（mao, z.g., (2010). trail-inducedapoptosis of human melanoma cells involves activation of caspase-4. apoptosis.)。因此，如何基于casp4基因来构建模拟als疾病的动物模型在als疾病研究和医药研发中尤为关键。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种基于casp4构建的模拟als疾病的模型及方法，能够有效的模拟als疾病的发展，且避免casp4基因所导致的细胞凋亡。
2、为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种基于casp4构建模拟als疾病的模型的方法，包括以下步骤：
4、（1）构建casp4基因敲入的打靶片段cag-lsl-hcasp4-wpre-polya；
5、（2）将grna、cas9 mrna和打靶片段cag-lsl-hcasp4-wpre-polya注射至小鼠受精卵中，培育受精卵并进行传代，获得casp4基因稳定遗传的hcasp4flox小鼠；
6、（3）然后再与cre工具鼠交配，获得双阳性杂合小鼠，即为casp4基因特异性表达在神经系统的小鼠模型。
7、进一步地，构建打靶片段cag-lsl-hcasp4-wpre-polya的过程为：
8、向包含cag启动子的质粒中插入loxp-pgk-neo-6*sv40pa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，构建打靶片段CAG-LSL-hCASP4-WPRE-polyA的过程为：
3.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，gRNA的序列为CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT-GGG。
4.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，CASP4基因为人源化CASP4基因，其序列号为ENST00000444739.7。
5.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，小鼠受精卵来自C57BL/6JGp小鼠。
6.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，获得CASP4稳定遗传的hCASP4flox小鼠动物模型的过程为：
7.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，筛选获得阳
8.根据权利要求1所述的基于CASP4构建模拟ALS疾病的模型的方法，其特征在于，用于鉴定双阳性杂合小鼠的扩增引物如下：
9.采用权利要求1~8任一项所述方法构建得到的模拟ALS疾病的小鼠模型。
10.权利要求9所述的小鼠模型在作为筛查防治ALS疾病药物和/或研究临床ALS发生发展病程的动物模型中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种基于casp4构建模拟als疾病的模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于casp4构建模拟als疾病的模型的方法，其特征在于，构建打靶片段cag-lsl-hcasp4-wpre-polya的过程为：
3.根据权利要求1所述的基于casp4构建模拟als疾病的模型的方法，其特征在于，grna的序列为ctccagtctttctagaagat-ggg。
4.根据权利要求1所述的基于casp4构建模拟als疾病的模型的方法，其特征在于，casp4基因为人源化casp4基因，其序列号为enst00000444739.7。
5.根据权利要求1所述的基于casp4构建模拟als疾病的模型的方法，其特征在于，小鼠受精...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷鹏，李晓江，贾青青，李世华，侯珺淇，朱高路，欧凯丽，何大健，赵月，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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