【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学，涉及一种莱茵衣藻工程菌及其制备方法和应用，尤其涉及一种合成金合欢烯的莱茵衣藻工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
1、莱茵衣藻作为研究合成生物学的模式生物之一，是测试各类重组产物表达的优秀实验平台。随着合成生物学和基因工程技术的发展，莱茵衣藻作为细胞工厂的角色愈发凸显，尤其在多种萜类化合物的高效生产方面展现了巨大潜力。
2、微藻细胞工厂中，常利用转基因表达、分子工具等工具对底盘生物进行遗传改造。通过优化密码子、修饰5’非翻译区、引入刺激内含子和内含子介导的基因增强效应(intron-mediated enhancement，ime)，可以有效实现细胞重编程。设计核基因沉默机制来消除参与这些复杂过程的单个基因，可以创造具有改进转基因表达能力的新型微藻菌株。另外，通过调整固定碳分配，可以增加脂质或甘油三酯(triacylglycerol，tag)的生物合成，实现游离脂肪酸(free fat acid，fa)积累或引发fa修饰。在非生物胁迫下，微藻可以积累高达60％干重的tag。过表达限速酶或多种限速酶的组合可以显著提高某些微藻中的tag水平。目前只有约5％的固定碳用于萜类化合物的合成，因此一般通过重定向异戊二烯途径代谢通路，以增加类异戊二烯的产量。同时将光合自养和混合培养结合，在莱茵衣藻中实现二萜香紫苏醇的生产(656mg/l)，集胞藻中倍半萜α-红没药烯滴度为179.4mg/l。另外，通过过表达八氢番茄红素合酶(phytoene synthase，psy)来提供类胡萝卜素前体供应，也是细胞工厂
3、微藻商业化生产的主要经济和技术挑战之一是避免细菌、真菌、其他藻类或原生动物的造成入侵，造成光生物反应器(pbr)中的污染和培养体系的崩溃。其中一种“作物保护”策略是使用适合在高盐度(例如杜氏盐藻)或低ph值和高温环境(如温泉红藻，cyanidioschyzon merolae)下生长的极端微生物藻类，相对于严重的污染物种，极端条件更有利于这些藻类的生长。然而，利用极端非生物环境来降低不良竞争对手污染风险的策略，限制了大多数用于生产代谢物质及其衍生产物的微藻物种。
4、综上所述，传统的萜类化合物合成主要依赖天然途径进行，但它们的代谢路径复杂，给基因工程化改造带来很大挑战。以往对莱茵衣藻中萜烯的增产研究主要集中在改造天然途径的限速酶、调节碳通量等方面，而利用人工合成途径合成萜烯的研究鲜有报道。此外，莱茵衣藻对无菌环境的严格要求限制了其大规模培养。因此，开发能够有效避免污染、且提高生产萜类化合物生产能力的策略具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种莱茵衣藻工程菌及其制备方法和应用，构建抗污染能力强的工程菌，可进行开放培养，继而可作为底盘藻株，有效应用于商业化生产。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种莱茵衣藻工程菌，所述莱茵衣藻工程菌包括表达nad+亚磷酸脱氢酶的莱茵衣藻。
4、本专利技术中，在莱茵衣藻中表达nad+亚磷酸脱氢酶，nad+亚磷酸脱氢酶能够将亚磷酸盐(phi)氧化为正磷酸盐(pi)，使得工程菌可以在亚磷酸盐作为唯一磷源的条件下生长，而其他微生物较难生长，在减少污染的同时还能够作为筛选条件使用。获得的具备较强的耐污染能力的工程菌，对培养控制条件要求低，可进行开放式培养，继而可作为底盘藻株，广泛应用于商业化生产。
5、优选地，所述nad+亚磷酸脱氢酶的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列。
6、seq id no.3：
7、mlpklvithrvhdeilqllaphcelmtnqtdstltreeilrrcrdaqammafmpdrvdadflqacpelrvvgcalkgfdnfdvdactargvwltfvpdlltvptaelaiglavglgrhlraadafvrsgefqgwqpqfygtgldnatvgilgmgaiglamadrlqgwgatlqyheakaldtqteqrlglrqvacselfassdfillalplnadtqhlvnaellalvrpgallvnpcrgsvvdeaavlaalergqlggyaadvfemedwaradrprlidpallahpntlftphigsavravrleiercaaqniiqvlagarpinaanrlpkaepaac。
8、优选地，所述莱茵衣藻工程菌还表达金合欢烯合酶。
9、优选地，所述金合欢烯合酶的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列。
10、本专利技术中，进一步在表达nad+亚磷酸脱氢酶的工程菌基础上表达金合欢烯合酶，可获得能够高效合成金合欢烯的工程菌，同时具备高抗污染能力，可开放培养，降低控制成本，有效应用于商业化生产。
11、seq id no.4：
12、mttsvpvplasqpqapqrkprtytpspwgdfflhhtpctpsqllsmkerakvkeqqvrqiiqetmassnllrklelvdtlqrlgvdyryyeeidqllrsvyddgdkdgggsddlyltslrfyllrkhgyttssdvfekfrdergsvssddascllmlydaahtrthgeeilddiiawsksrlqslleeknlepelaeevrcaletprfrrvkrvearryisayekkggrdgtilefakldynisqaiycdelkeltvwwkdfqshidmrftrdrlvelhfwmlgvihepyysysrimmtkffifgnffddlydnygtteesdvftaamersvtfisnyytasiisgvdkiftislikkihnddrwdeqiahqlsaglkvllasilnatnkieeelklqgnmhaelvkkmvidtaksyhaevkwrdehfvpatvedhlqisipssgcmqitnlalissrgnmttredvewvftfpkivrgacivgricndimshereqasldhvastvqtcmkqygvtteeaneklraviemawmdivqdnleqerpialldtminvariadfiykredaytlsfslkgiigsmyvysv。
13、优选地，所述莱茵衣藻工程菌的出发菌株包括莱茵衣藻cc5325或莱茵衣藻iup。
14、本专利技术中，所述莱茵衣藻iup藻株包括胆碱激酶基因(crck)(为根据莱茵衣藻密码子偏好性优化后的酿酒酵母胆碱激酶基因)和，异戊烯基磷酸激酶基因(cripk)(为根据莱茵衣藻密码子偏好性优化后的拟南芥异戊烯基磷酸激酶基因)，可以3-甲基-2-丁烯-1-醇为底物，合成异戊烯基焦磷酸(ipp)或二甲基丙烯基焦磷酸(dmapp)。
15、第二方面，本专利技术提供一种构建第一方面所述的莱茵衣藻工程菌的方法，所述方法包括：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述莱茵衣藻工程菌包括表达NAD+亚磷酸脱氢酶的莱茵衣藻。
2.根据权利要求1所述的莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述NAD+亚磷酸脱氢酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述莱茵衣藻工程菌还表达金合欢烯合酶；
4.根据权利要求1-3任一项所述的莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述莱茵衣藻工程菌的出发菌株包括莱茵衣藻CC5325或莱茵衣藻IUP。
5.一种构建权利要求1-4任一项所述的莱茵衣藻工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的莱茵衣藻工程菌的方法，其特征在于，所述导入的方法包括将所述NAD+亚磷酸脱氢酶的编码核酸插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入莱茵衣藻；或，
7.根据权利要求5所述的莱茵衣藻工程菌的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述金合欢烯合酶的编码核酸插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入莱茵衣藻；或，
8.权利要求1-4任一项所述的莱
9.一种合成金合欢烯的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-4任一项所述的莱茵衣藻工程菌合成金合欢烯。
10.根据权利要求9所述的合成金合欢烯的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求3所述的莱茵衣藻工程菌，进行产物纯化，得到金合欢烯；
...【技术特征摘要】
1.一种莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述莱茵衣藻工程菌包括表达nad+亚磷酸脱氢酶的莱茵衣藻。
2.根据权利要求1所述的莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述nad+亚磷酸脱氢酶的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述莱茵衣藻工程菌还表达金合欢烯合酶；
4.根据权利要求1-3任一项所述的莱茵衣藻工程菌，其特征在于，所述莱茵衣藻工程菌的出发菌株包括莱茵衣藻cc5325或莱茵衣藻iup。
5.一种构建权利要求1-4任一项所述的莱茵衣藻工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的莱茵衣藻工程菌的方法，其特...
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