【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于筛查mps i、ii、iiia、iiib、iva、vi和vii的试剂、方法和试剂盒。
技术介绍
1、用于溶酶体贮积障碍(lsd)亚类的治疗已经变得可行，且在许多情况下，治疗的及早开始会导致临床改善。这些鼓舞人心的结果已经在lsd的新生儿筛查中产生广泛分布的兴趣。
2、已经确立新生儿筛查程序来量化与这些可治疗的疾病有关的代谢物的水平。纽约州(new york state)现在提供克拉伯病筛查，并且关于lsd扩张的新生儿筛查的新近立法已经在几个其它州中通过，并在中国台湾进行关于庞皮病和法布里病的新生儿筛查。
3、mps(mps i至vii)是由降解糖胺聚糖(包括类肝素(heparan)、皮肤素、角质素或硫酸软骨素)的溶酶体酶之一的缺乏造成的一组代谢疾病/综合征。有关的酶包括五种硫酸酯酶、四种外切糖苷酶和一种非水解的乙酰基-n-转移酶。这些综合征导致在溶酶体中积聚未降解的或部分地降解的糖胺聚糖，从而导致不可逆的多系统器官损伤。
4、尽管治疗最近已经变得可用于一些mps综合征，来自这些治疗的最佳益处要求在不可逆的症状发作之前开始治疗。mps综合征的及早检测会使治疗的潜在益处最大化，因而需要开发适用于及早诊断的试验。同样需要开发快速的、廉价的和可靠的诊断程序，其使用干燥血斑点(dbs)作为样品来源，诸如呈送给新生儿筛查实验室的那些。
5、因此，需要用于溶酶体酶活性的新生儿筛查的方法和试剂，特别是允许改善mpsi、ii、iiia、iiib、iva、vi和vii的筛查的方法和试
技术实现思路
1、本专利技术提供了用于筛查mps i、ii、iiia、iiib、iva、vi和vii的试剂，用于筛查mpsi、ii、iiia、iiib、iva、vi和vii的方法，和包括所述试剂的试剂盒。
2、在一个方面，本专利技术提供了用于测定与溶酶体贮积病有关的一种或多种酶的方法。
3、在第一个实施方案中，所述方法包括：
4、(a)使样品与第一溶液接触以提供包含一种或多种溶酶体酶的溶液；
5、(b)使溶液中的一种或多种溶酶体酶与要分析的每种溶酶体酶的酶底物接触，和将所述底物与所述酶一起温育足以提供包含所述样品中存在的每种溶酶体酶的酶产物的溶液的时间，
6、其中每种溶酶体酶的酶底物是具有碳水化合物部分和糖苷配基部分且具有下式的化合物：
7、
8、其中s是这样的碳水化合物部分，其当与所述糖苷配基部分共价地偶联时提供选自以下的酶的底物：
9、(i)α-l-艾杜糖醛酸酶(alpha-l-iduronidase)；
10、(ii)艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(iduronate 2-sulfatase)；
11、(iii)类肝素n-硫酸酯酶；
12、(iv)n-乙酰基-α-d-氨基葡糖苷酶；
13、(v)n-乙酰基半乳糖胺6-硫酸酯(sulfate)-硫酸酯酶；
14、(vi)n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶；和
15、(vii)β-葡糖醛酸糖苷酶；
16、l2是包含1-20个碳原子的连接体(linker)，其中一个或多个碳原子可以被选自n、o和s的杂原子替换，和/或一个或多个碳原子可以被c1-c6烷基或卤素取代；
17、l3是包含1-20个碳原子的连接体，其中一个或多个碳原子可以被选自n、o或s的杂原子替换，和/或一个或多个碳原子可以被c1-c6烷基或卤素取代；
18、l4是任选的，且当存在时是包含1-20个碳原子的连接体，其中一个或多个碳原子可以被选自n、o或s的杂原子替换)，和/或一个或多个碳原子可以被c1-c6烷基或卤素取代；
19、r1是c1-c10烷基或c1-c10烷氧基；
20、r2在每次出现时独立地选自c1-c10烷基、c1-c10烷氧基、卤素、硝基、-c(＝o)nhr或-c(＝o)or，其中r是c1-c8烷基；
21、r3是c1-c10烷基或被取代的或未被取代的c6-c10芳基；且
22、n是0、1、2、3或4；和
23、(c)确定所述酶产物中的一种或多种的量。
24、在某些实施方案中，所述方法进一步包括使所述酶产物与糖原水解酶(glycohydrolase)接触以提供第二酶产物。在某些实施方案中，所述方法进一步包括添加抑制剂以阻断作用于n-乙酰基半乳糖胺6-硫酸酯-硫酸酯酶或n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶的底物的内源性糖原水解酶活性。
25、在第二个实施方案中，所述方法包括：
26、(a)使样品与第一溶液接触以提供包含一种或多种溶酶体酶的溶液；
27、(b)使溶液中的一种或多种溶酶体酶与要分析的每种溶酶体酶的酶底物接触，和将所述底物与所述酶一起温育足以提供包含存在于样品中的每种溶酶体酶的第一酶产物的溶液的时间；
28、(c)使所述第一酶产物遇到糖原水解酶以提供易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的每种第一酶产物的第二酶产物；和
29、(d)确定一种或多种第一酶产物和/或一种或多种第二酶产物的量。
30、在以上方法中，某些第一酶产物不易于通过糖原水解酶实现进一步酶促反应。不易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的第一酶产物由选自以下的酶的作用提供：
31、(a)α-l-艾杜糖醛酸酶；
32、(b)n-乙酰基-α-d-氨基葡糖苷酶；和
33、(c)β-葡糖醛酸糖苷酶。
34、易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的第一酶产物由选自以下的酶的作用提供：
35、(a)艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；
36、(b)类肝素n-硫酸酯酶；
37、(c)n-乙酰基半乳糖胺6-硫酸酯-硫酸酯酶；和
38、(d)n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶。
39、在某些实施方案中，所述方法进一步包括添加抑制剂以阻断作用于n-乙酰基半乳糖胺6-硫酸酯-硫酸酯酶或n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶的底物的内源性糖原水解酶活性，其中所述抑制剂不会显著地抑制步骤(c)的糖原水解酶的活性。
40、在以上方法中，所述一种或多种溶酶体酶包含选自以下的酶：
41、(a)α-l-艾杜糖醛酸酶；
42、(b)艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；
43、(c)类肝素n-硫酸酯酶；
44、(d)n-乙酰基-α-d-氨基葡糖苷酶；
45、(e)n-乙酰基半乳糖胺6-硫酸酯-硫酸酯酶；
46、(f)n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶；和
47、(g)β-葡糖醛酸糖苷酶。
48、在以上方法的某些实施方案中，在使溶酶体酶与底物接触之前、之后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于测定与溶酶体贮积病有关的酶的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使所述酶产物与糖原水解酶接触以提供第二酶产物。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括添加抑制剂以阻断作用于N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶的底物的内源性糖原水解酶活性。
4.一种用于测定一种或多种溶酶体酶的酶活性的方法，其包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的第一酶产物通过选自以下的酶的作用来提供：
6.根据权利要求4所述的方法，其中不易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的第一酶产物由选自以下的酶的作用提供：
7.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括添加抑制剂以阻断作用于N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶的底物的内源性糖原水解酶活性，
8.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述一种或多种溶酶体酶包含选自以下的酶：
9.根据权利要求1或4所述的方法，所述方法进一步包括在使溶酶体酶与底物接触之前、之后或同时加
10.根据权利要求1或4所述的方法，所述方法进一步包括在确定所述酶产物中的一种或多种的量之前猝灭酶反应。
11.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述样品是血液或组织样品。
12.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述样品是干燥血斑点。
13.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述糖原水解酶选自：人己糖胺酶A、细菌N-乙酰基己糖胺酶、细菌β-N-乙酰基半乳糖胺酶、β-半乳糖苷酶(曲霉菌属)和α-葡萄糖苷酶(酵母)。
14.根据权利要求3或7所述的方法，其中所述抑制剂选自：(Z)-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖亚基)-氨基N-苯基氨基甲酸酯、1-脱氧野尻霉素、栗精胺、苦马豆素、打碗花精B2、isofagamine、达菲、葡糖酸肟基内酯、葡糖醛酸和它的内酯和内酰胺、扎那米韦、米格列醇、苯乙基取代的葡萄糖-和半乳糖-咪唑、N-羟基乙基脱氢野尻霉素、GalNAc噻唑啉和GlcNAc噻唑啉。
15.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括质谱分析。
16.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括通过质谱分析来确定每种产物与它的内部标准品的比率。
17.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括串联质谱分析，其中产生产物和它们的内部标准品的母离子，分离，并进行碰撞诱导的解离以提供产物片段离子和内部标准品片段离子。
18.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括对比产物片段离子和内部标准品片段离子的峰强度以计算产物的量。
19.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括通过液相色谱法或通过流动注射将产物引导至质谱仪。
20.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括荧光分析。
21.根据权利要求1或4所述的方法，所述方法进一步包括使用酶产物的量来确定所述样品是否来自用于治疗与一种或多种溶酶体酶缺乏有关的病症的候选物。
22.根据权利要求4所述的方法，其中所述底物具有碳水化合物部分和糖苷配基部分且具有下式：
23.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于类肝素N-硫酸酯酶且具有下式：
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述底物具有下式：
25.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶且具有下式：
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述底物具有下式：
27.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶且具有下式：
28.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物具有下式：
29.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于β-葡糖醛酸糖苷酶且具有下式：
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述底物具有下式：
31.一种化合物，其具有碳水化合物部分和糖苷配基部分且具有下式：
32.根据权利要求31所述的化合物，其中L2是-(CH2)n-，其中n是1-6。
33.根据权利要求31所述的化合物，其中L3是-(CH2)m-，其中m是1-12。
34.根据权利要求31所述的化合物，其中L4是-(CH2)n-，其中n是1-6。
【技术特征摘要】
1.一种用于测定与溶酶体贮积病有关的酶的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使所述酶产物与糖原水解酶接触以提供第二酶产物。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括添加抑制剂以阻断作用于n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶的底物的内源性糖原水解酶活性。
4.一种用于测定一种或多种溶酶体酶的酶活性的方法，其包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的第一酶产物通过选自以下的酶的作用来提供：
6.根据权利要求4所述的方法，其中不易于通过糖原水解酶实现的进一步酶促反应的第一酶产物由选自以下的酶的作用提供：
7.根据权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括添加抑制剂以阻断作用于n-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯-硫酸酯酶的底物的内源性糖原水解酶活性，
8.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述一种或多种溶酶体酶包含选自以下的酶：
9.根据权利要求1或4所述的方法，所述方法进一步包括在使溶酶体酶与底物接触之前、之后或同时加入要分析的每种溶酶体酶的内部标准品。
10.根据权利要求1或4所述的方法，所述方法进一步包括在确定所述酶产物中的一种或多种的量之前猝灭酶反应。
11.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述样品是血液或组织样品。
12.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述样品是干燥血斑点。
13.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述糖原水解酶选自：人己糖胺酶a、细菌n-乙酰基己糖胺酶、细菌β-n-乙酰基半乳糖胺酶、β-半乳糖苷酶(曲霉菌属)和α-葡萄糖苷酶(酵母)。
14.根据权利要求3或7所述的方法，其中所述抑制剂选自：(z)-o-(2-乙酰氨基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖亚基)-氨基n-苯基氨基甲酸酯、1-脱氧野尻霉素、栗精胺、苦马豆素、打碗花精b2、isofagamine、达菲、葡糖酸肟基内酯、葡糖醛酸和它的内酯和内酰胺、扎那米韦、米格列醇、苯乙基取代的葡萄糖-和半乳糖-咪唑、n-羟基乙基脱氢野尻霉素、galnac噻唑啉和glcnac噻唑啉。
15.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括质谱分析。
16.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括通过质谱分析来确定每种产物与它的内部标准品的比率。
17.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括串联质谱分析，其中产生产物和它们的内部标准品的母离子，分离，并进行碰撞诱导的解离以提供产物片段离子和内部标准品片段离子。
18.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括对比产物片段离子和内部标准品片段离子的峰强度以计算产物的量。
19.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括通过液相色谱法或通过流动注射将产物引导至质谱仪。
20.根据权利要求1或4所述的方法，其中确定所述酶产物的量包括荧光分析。
21.根据权利要求1或4所述的方法，所述方法进一步包括使用酶产物的量来确定所述样品是否来自用于治疗与一种或多种溶酶体酶缺乏有关的病症的候选物。
22.根据权利要求4所述的方法，其中所述底物具有碳水化合物部分和糖苷配基部分且具有下式：
23.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于类肝素n-硫酸酯酶且具有下式：
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述底物具有下式：
25.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于n-乙酰基-α-d-氨基葡糖苷酶且具有下式：
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述底物具有下式：
27.根据权利要求1或22所述的方法，其中所述底物用于...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·H·戈尔伯，A·B·库马尔，F·霍克特，Z·斯巴希尔，M·N·巴斯纳斯罗德里格兹，F·图雷克，R·C·斯科特，
申请(专利权)人：华盛顿大学商业中心，
类型：发明
国别省市：
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