【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别是涉及一种熊猫pla2g10基因的合成方法及其腺病毒表达载体构建方法。
技术介绍
1、在哺乳动物分泌型磷脂酶a2(pla2)中，x组酶对磷脂酰胆碱(细胞膜和脂蛋白的主要磷脂)具有最强的水解能力，炎性刺激激活pla2g10会对脂质启动瀑布效应造成细胞损伤，膜磷脂的大量分解将使细胞的完整性遭致破坏，因为这一特性，pla2g10被认为是对炎症有促进作用。
2、pla2g10水解磷脂诱导花生四烯酸的有效释放，导致环氧化酶依赖性前列腺素形成，以及在各种细胞类型中溶血磷脂酰胆碱(lysopc)的显著产生，包括巨噬细胞、脾细胞和结肠癌细胞，由于这一特性，大多数先前的研究结果表明pla2g10通过驱动aa代谢促进炎症。此外，pla2g10在诱导低密度脂蛋白(ldl)的强效脂解的同时，也对脂蛋白结合pc进行水解，产生更多的致动脉粥样硬化的小密度脂蛋白颗粒，促进巨噬细胞形成泡沫细胞，导致在动脉粥样硬化中发挥作用。
3、pla2g10在各个领域都有很高的应用价值和广泛的应用前景，其在生物体内已发现了多种代谢、免疫相关功能，然而对于熊猫来源的基因研究尚浅，构建熊猫来源基因的腺病毒载体对后续在熊猫上的研究有深远意义。目前，人、鼠、老虎等物种的pla2g10基因已经克隆到，并在ncbi网站上能够查询，但是ncbi网站公布的熊猫pla2g10基因的编码序列(cds)经验证为一错误序列，而熊猫pla2g10基因的正确cds尚未正式公布。为此，我们提供了一种熊猫pla2g10基因的合成方法及其腺病毒表达载体构建方法
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种熊猫pla2g10基因的合成方法及其腺病毒表达载体构建方法，通过采用熊猫pla2g10基因的合成方法制备熊猫pla2g10，并构建基于熊猫pla2g10的腺病毒表达载体构建方法，解决了目前熊猫pla2g10基因的正确编码序列尚未公开的问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术为一种熊猫pla2g10基因的合成方法，包括如下步骤：
4、(1)查询小鼠的pla2g10基因，找到小鼠pla2g10基因的编码序列；
5、(2)用小鼠pla2g10基因的编码序列去熊猫的基因转录数据库中进行blast比对，找出同源性最高的基因片段；
6、(3)以同源性最高的基因片段为基础，设计上下游引物5’-atggtggagga gggcacg-3’和5’-tcagtcacacttgggtgagc-3’；
7、(4)提取熊猫的mrna；
8、(5)5’race扩增末端序列：设计六种引物，分别为5’adaptor、5.3’outer、rc761-r2、rc761-r1、rc761-rt2和rc761-rt1；
9、(6)cdna合成：将1ul特异性引物rc761-rt1/rc761-rt2加入到试剂管中，加入rnase-free water至10ul后混匀离心，65℃孵育5min后进行冰浴2min，再加入10ulreverse transcriptase mix混匀离心，50℃孵育30min后进行85℃加热1min；
10、(7)rnase h消化：在pcr管中加入cdna和rnase h mix先后进行三种不同温度的孵育处理，冰浴降温后再加入rnase-free wate、异丙醇和buffer b2，混合后加入纯化柱，经dna胶回收试剂盒处理后倒掉收集管中的液体，在吸附膜中央加入rnase-free water并进行室温静置，获得纯化的cdna；
11、(8)加c尾：在pcr管中分别加入cdna、dntp和5×tdt buffer，经孵育和冰浴后再加入tdt酶，再进行三种不同温度的孵育处理；
12、(9)pcr扩增熊猫pla2g10 mrna的5’端序列；
13、(10)将5’race巢式pcr第二轮产物进行测序、拼接，获得pdpla2g10的cdna全长序列。
14、本专利技术进一步优选为，所述步骤(3)中的引物干粉使用双蒸水溶解稀释至终浓度为5umol/ml，并置于-20℃环境中进行保存。
15、本专利技术进一步优选为，所述步骤(4)中提取熊猫mrna的具体步骤为：
16、(41)用研钵将组织样品研磨至粉末，称取100mg样品粉末置于提前液氮预冷的2ml样品管中，加入1ml的trizol后置于冰上；
17、(42)使用匀浆机匀浆1min将组织打碎裂解，每个不同样品之间先用75％乙醇配置的depc水洗，再用灭菌的depc水洗涤，接着将样品管置于装有冰水混合物的烧杯中，保持低温匀浆；
18、(43)匀浆后的样品管经离心获取上清液，将上清液置于含有氯仿的ep管中，混匀涡旋后置于冰上静置，再次离心获得上清液，取上清液加入等量异丙醇，混匀静置后再进行离心并弃去上清液，加入1ml 75％乙醇配置的depc水洗涤沉淀；
19、(44)经离心后弃去上清液，再次离心处理，使用10μl的枪头吸掉液体部分，室温放置一段时间将沉淀晾干；
20、(45)干燥后的rna根据沉淀大小用适量的depc水溶解，通过1％核酸胶检测rna的完整性，使用核酸蛋白仪测定rna的浓度，并用depc水调整rna的浓度为1μg/μl。
21、本专利技术进一步优选为，所述步骤(43)的具体内容为：匀浆后的样品管在4℃环境中以12000r/min转速离心15min，抽取800ul上清液置于含有160ul氯仿的ep管中，混匀涡旋后置于冰上静置5min，再置于4℃环境中以12000r/min转速离心15min获得上清液，取上清液加入等量异丙醇，混匀静置10min后在4℃环境中以12000r/min转速离心10min，随后弃去上清液并加入1ml 75％乙醇配置的depc水洗涤沉淀。
22、本专利技术进一步优选为，所述步骤(44)的具体内容为：在4℃环境中以12000r/min转速离心10min，弃去上清液后以同样的离心条件再次进行离心处理，使用10μl的枪头吸掉液体部分，室温放置一段时间将沉淀晾干。
23、本专利技术进一步优选为，所述步骤(7)中rnase h消化的具体步骤为：
24、(71)在0.2ml pcr管中加入20ul cdna和7ul rnase h mix，先经过37℃孵育20min，再进行70℃孵育10min，最后经16℃孵育1min后冰浴5min；
25、(72)加入73ul rnase-free wate、130ul异丙醇和390ul buffer b2，混合后加入纯化柱，按照sanprep柱式dna胶回收试剂盒加入500ul wash solution，以9000g/min的流速处理30s；
26、(73)在吸附膜中央加入45ulrnase-free water并室温静置本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中的引物干粉使用双蒸水溶解稀释至终浓度为5umol/mL，并置于-20℃环境中进行保存。
3.根据权利要求1所述的一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中提取熊猫mRNA的具体步骤为：
4.根据权利要求3所述的一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(43)的具体内容为：匀浆后的样品管在4℃环境中以12000r/min转速离心15min，抽取800uL上清液置于含有160uL氯仿的EP管中，混匀涡旋后置于冰上静置5min，再置于4℃环境中以12000r/min转速离心15min获得上清液，取上清液加入等量异丙醇，混匀静置10min后在4℃环境中以12000r/min转速离心10min，随后弃去上清液并加入1mL 75％乙醇配置的DEPC水洗涤沉淀。
5.根据权利要求3所述的一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(4
6.根据权利要求1所述的一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(7)中RNase H消化的具体步骤为：
7.根据权利要求1所述的一种熊猫PLA2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(8)中加C尾的具体步骤为：在0.2mL PCR管中分别加入38.5uL cDNA、0.5uL dNTP和10uL 5×TdT Buffer，经过94℃孵育3min后冰浴处理3min，再加入1.5uL TdT酶，最后分别在37℃下孵育15min，70℃下孵育10min和16℃下孵育1min。
8.一种基于熊猫PLA2g10基因的腺病毒表达载体构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种熊猫pla2g10基因的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种熊猫pla2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中的引物干粉使用双蒸水溶解稀释至终浓度为5umol/ml，并置于-20℃环境中进行保存。
3.根据权利要求1所述的一种熊猫pla2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中提取熊猫mrna的具体步骤为：
4.根据权利要求3所述的一种熊猫pla2g10基因的合成方法，其特征在于，所述步骤(43)的具体内容为：匀浆后的样品管在4℃环境中以12000r/min转速离心15min，抽取800ul上清液置于含有160ul氯仿的ep管中，混匀涡旋后置于冰上静置5min，再置于4℃环境中以12000r/min转速离心15min获得上清液，取上清液加入等量异丙醇，混匀静置10min后在4℃环境中以12000r/min转速离心10min，随后弃去上清液并加入1ml 75％乙醇配置的depc水洗涤沉淀。
【专利技术属性】
技术研发人员：冯斌，廖文浩，王海瑞，吴德，方正锋，车炼强，林燕，徐盛玉，卓勇，花伦，江雪梅，李健，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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