【技术实现步骤摘要】
本专利技术创造属于生物医药，尤其是涉及一种多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肿瘤严重威胁人类健康。临床应用的抗肿瘤药物有化疗药物、生物制剂等，但这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，常具有较大毒副作用。天然产物治疗疾病具有“多成分-多靶点”特点，现为临床所重视。药用真菌多具有抗肿瘤作用，且通常毒副作用较小、疗效较为显著。真菌产生的外泌体可能是其部分活性成分，可以跨物种调控人体细胞，同时可以被稳定吸收进入体内而发挥其特异性的药理作用。外泌体由特定的蛋白质、脂质和核酸物质组成，携带多种mirna，能够与靶细胞膜表面的特定受体结合，调控多种信号通路，调节各种生理和病理过程。外泌体也可能作为药物载体协助药物更好的进入细胞中发挥作用。
2、牛樟芝（antrodia cinnamomea）是多孔真菌，经长期临床应用，在保护肝脏、抗肿瘤、治疗轻度认知障碍、降血糖、降胆固醇、降血压、抗痛风及保护皮肤等方面具有显著药效。能否从牛樟芝中提取外泌体，并用于抗肿瘤治疗中，未见报道。
3、铜死亡是一种由铜引发、依赖于线粒体呼吸的新型细胞死亡途径。细胞内异常累积的铜离子与三羧酸循环中脂酰化组分直接结合，这些线粒体脂化蛋白的聚集以及随后出现的铁-硫簇蛋白的丢失诱发蛋白质毒性应激，进而导致细胞死亡。对于依赖线粒体代谢供能的恶性肿瘤，铜死亡是一种潜在的治疗靶点。已有研究表明，铜离子载体可通过诱发铜死亡应用于线粒体代谢活跃的恶性肿瘤。然而，在抗肿瘤药物的开发中，诱导肿瘤细胞铜死亡的药物较少，效果并不理想。并且铜离子药物
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术创造旨在提出一种多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体（exo(ac)-ghq-cu），多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体的制备方法以及多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体在制备抗肿瘤药物中的应用。
2、为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：
3、第一方面，本申请提供了一种多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体，其包括牛樟芝外泌体，所述牛樟芝外泌体上修饰有多肽和铜离子。
4、具体的，所述多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体的示意图如下所示：
5、。
6、在其中一个可能的实施方式中，多肽与牛樟芝外泌体通过酰胺键连接；铜离子与多肽中的氨基以络合键的形式结合。该结构在本实验条件下具有较好的稳定性，能更好的被细胞摄取并发挥其药理功能。
7、在其中一个可能的实施方式中，所述多肽为甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽。
8、在其中一个可能的实施方式中，所述的牛樟芝外泌体的提取方法包括以下步骤：
9、将牛樟芝菌丝液态发酵培养得发酵液；
10、将发酵液连续离心后取上清；
11、将取得的上清液超速离心后取沉淀悬浮于pbs中；
12、将悬浮液用滤膜过滤，得到的滤液即为牛樟芝外泌体。
13、进一步的，所述的牛樟芝外泌体的提取方法包括以下步骤：
14、将牛樟芝菌丝液态发酵培养得发酵液；所述的液态发酵培养基为：9~11g/l麸皮，0.9~1.1g/l玉米粉提取物，18~22g/l葡萄糖，1.9~2.1g/l七水硫酸镁，2.9~3.1g/l磷酸二氢钾，0.1~0.3mg/l vb1，0.2~0.4mg/l vb2，thermo 蛋白胨3g/l；所述液态发酵培养条件为：接种量5-15%，温度27.5℃，转速120rpm，培养7天；
15、将发酵液连续离心，第一次于4℃，3000g，离心20-30min，离心后取上清，弃沉淀；第二次于4℃，10000g，离心50-60 min，离心后取上清，弃沉淀；
16、将取得的上清超速离心，于超速冷冻离心机中4℃，150000g，离心70-90min，离心后取沉淀，弃上清，沉淀悬浮于pbs（磷酸缓冲盐溶液）中；
17、将悬浮液用0.22μm滤膜过滤，得到的滤液即为牛樟芝外泌体。
18、第二方面，本申请提供一种多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体的制备方法，其包括如下步骤：
19、将甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽溶解于溶剂中形成溶液，向该溶液中加入boc2和dipea，反应结束后经浓缩纯化得到中间体1；
20、将中间体1溶解于溶剂中形成溶液，向该溶液中加入edc/nhs，反应结束后经浓缩纯化得到中间体2；
21、将中间体2和牛樟芝外泌体加入溶剂中溶解，反应结束后经浓缩得到中间体3；
22、将中间体3溶解于溶剂中形成溶液，向该溶液中缓慢滴加三氟乙酸，反应结束后经浓缩得到中间体4，即甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽-修饰的牛樟芝外泌体；
23、将中间体4和含铜离子化合物加入到去离子水中溶解，反应结束后，反应液经过滤、透析、冻干后得到甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽-cu修饰的牛樟芝外泌体。
24、进一步的，所述含铜离子化合物包括氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的任一种。
25、进一步的，所述多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体的制备方法包括如下步骤：
26、取甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽500mg放入到三口瓶中，加入四氢呋喃/二氯甲烷/甲醇 10-20ml，反应温度20-30摄氏度，搅拌溶解，加入boc2o 450-650mg和dipea 270-400mg，继续搅拌溶解，加入后及时用氮气保护，反应时间6-8小时，反应结束后，将体系减压浓缩，使用正相方法进行纯化（主要是去除boc2o），得到中间体1 600-640mg；
27、将中间体1 600mg放入到三口瓶中，加入四氢呋喃/二氯甲烷/1，4-环氧六环10-20ml，升温至30-40摄氏度（根据溶剂沸点不同，所选择温度也不同），搅拌溶解，加入edc420-540mg和nhs 400-490mg，继续搅拌溶解，加入后及时用氮气保护，反应时间2-3小时，反应结束后，将体系减压浓缩，使用正相方法进行纯化，得到中间体2 600-620mg；
28、将中间体2 600mg和牛樟芝外泌体100-150mg放入到三口瓶中，加入四氢呋喃/二氯甲烷/1，4-环氧六环10-20ml，升温至30-40摄氏度（根据溶剂沸点不同，所选择温度也不同），搅拌溶解，加入后及时用氮气保护；反应时间1-2小时，反应结束后，将体系减压浓缩，得到中间体3 640-680mg；
29、将中间体3 640mg放入到三口瓶中，加入二氯甲烷10-15ml中，缓慢滴加三氟乙酸2-3ml，滴加完毕后，反应时间1-2小时，减压浓缩，脱掉氨基上的boc基团，得到中间体4，即甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽-修饰的牛樟芝外泌体（exo(ac)-ghq）440mg-500mg；
30、修饰铜离子：将中间体4 440mg和氯化铜固体100-120mg加入到去离子水中溶解，升温至30-40摄氏度，反应时间16-18小时，反应结束后，将反应液过滤，使用8000本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体，其特征在于：包括牛樟芝外泌体，所述牛樟芝外泌体上修饰有多肽和铜离子。
2.根据权利要求1所述的多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体，其特征在于：多肽与牛樟芝外泌体通过酰胺键连接；铜离子与多肽中的氨基以络合键的形式结合。
3.根据权利要求1所述的多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体，其特征在于：所述多肽为甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的牛樟芝外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体的制备方法，其特征在于，所述含铜离子化合物包括氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的任一种。
7.根据权利要求5所述的多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体的制备方法，其特征在于，Boc2O和DIPEA的摩尔比为1：1；EDC和NHS的摩尔比为1：1。
8.根据权利要求1-3任一项所述的多肽-Cu修饰的牛樟芝外泌体在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体，其特征在于：包括牛樟芝外泌体，所述牛樟芝外泌体上修饰有多肽和铜离子。
2.根据权利要求1所述的多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体，其特征在于：多肽与牛樟芝外泌体通过酰胺键连接；铜离子与多肽中的氨基以络合键的形式结合。
3.根据权利要求1所述的多肽-cu修饰的牛樟芝外泌体，其特征在于：所述多肽为甘氨酰-组氨酰-谷氨酰胺三肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的牛樟芝外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，刘慧娟，汉京霞，张恒，赖科观，贾子跃，
申请(专利权)人：熙海医脉天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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