【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤细胞捕获，尤其涉及一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法。
技术介绍
1、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctcs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，目前其已被认为是一个可靠的预后指标。ctcs检测在治疗过程中随时预测疾病的进展和患者的存活时间，检测结果能够更早地为医生提供更多的信息，从而能够制定更明确的治疗方案。近年来研究发现，血小板通过促进肿瘤上皮间质转化，新生血管的生成，癌栓的形成和免疫逃逸等生物学功能与ctcs关系密切，从而加快了肿瘤的进程。
2、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,emt)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过emt，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型，其程序性激活可使肿瘤细胞获得异常的活动能力，经过血液循环传播后，最终形成继发性转移灶。鉴于emt是诱导ctcs并促进肿瘤转移的一个关键素，ctc的emt在预后诊断和靶向治疗方面正受到越来越多的关注，目前，emt主要的标志性蛋白为波形蛋白(vimentin)，其是一种iii型中间丝蛋白，分子量约为54kda。波形蛋白可锚定和支撑间充质细胞胞质内的细胞器，上皮间质转化期间，波形蛋白的表达上调。
3、研究表明人外周血中的ctc数量极少，所以要求检测方法应具有高敏感性及
4、随着ctc检测技术的不断发展，目前常用的ctc检测技术有免疫磁珠法、纳米微流控芯片技术。免疫磁珠法成本高，无法实现自动化染色，时间成本较大。纳米微流控芯片对技术要求较高，需要比较集成化的仪器作为辅助，开发周期长，检测价格昂贵。
5、为此本专利技术的目的主要是在间质型细胞检测中节约成本、减少研发周期，提高ctc的捕获效率，实现血液中肿瘤细胞的快速检测，为肿瘤患者的诊断和用药治疗提供辅助依据。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的问题，在间质型细胞检测中节约成本、减少研发周期，提高ctc的捕获效率，实现血液中肿瘤细胞的快速检测，为肿瘤患者的诊断和用药治疗提供辅助依据，而提出的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，包括以下步骤：
4、s1芯片预处理：
5、1)在金属筛网芯片上镀惰性金属，确保芯片孔径大小均一，镀均匀；
6、2)将芯片置于无水乙醇中浸泡；
7、3)准备烧杯，并在烧杯中依次加入去离子水，氨水和双氧水，并放入油浴锅加热，然后将芯片置于烧杯中加热；
8、4)加热完成后，清洗芯片；
9、5)对芯片进行干燥，并保存备用；
10、s2，高分子包被芯片：
11、1)取巯基化透明质酸钠(ha-sh)加入ep管中，随后向ep管内加入金属筛网芯片，通过振荡器共混孵育；
12、2)孵育完成后，吸去巯基化透明质酸钠，加入pbs缓冲液进行洗涤，取出芯片自然风干；
13、3)将芯片取出置于洁净的孔板中，在芯片上加入edc和sulfo-nhs溶液，避光孵育；
14、4)孵育完成后，加入pbs缓冲液对芯片进行洗涤，取出芯片自然风干；
15、5)将风干芯片置于新的孔板中，并在芯片上加入含vimentin抗体的mes缓冲液，孵育；
16、6)孵育完成后加入pbs缓冲液对芯片进行洗涤；
17、7)bsa溶液，孵育；
18、8)孵育完成后加入pbs对芯片进行洗涤；
19、9)将芯片置于pbs缓冲液中保存备用；
20、s3，间质化细胞准备：
21、(1)hela细胞培养：
22、细胞培养基：mem培养基、7～12％胎牛血清、0.3～1.5％双抗；
23、培养条件：3～7％二氧化碳，35～40℃培养箱中使用t25细胞培养瓶对hela细胞进行培养；
24、(2)细胞计数：
25、梯度稀释后使用显微计数仪对hela细胞进行计数，将一定数量的hela细胞置于pbs中混合备用；
26、s4，间质化细胞捕获。
27、优选的，所述步骤s1中，所述金属筛网芯片的直径为8.8mm，孔径为18*18μm，所述金属筛网芯片镀的惰性金属为金、银、铂中的一种；将芯片置于无水乙醇中浸泡时间为2min；在烧杯中依次加入去离子水，氨水和双氧水，并放入油浴锅加热，然后将芯片置于烧杯中加热；将金属筛网芯片置于烧杯中加热的时间为5min；加热完成后，把芯片依次置于去离子水、无水乙醇、无水乙醇中清洗；使用氮气枪对芯片进行干燥。
28、优选的，所述步骤s2中，1)中，取3ml巯基化透明质酸钠(ha-sh)加入5ml ep管中，随后向ep管内加入金属筛网芯片，振荡器上以200rpm共混孵育2h；
29、2)中孵育完成后，吸去巯基化透明质酸钠，加入3ml pbs缓冲液进行洗涤，每次3min，重复洗涤2次，取出芯片自然风干；
30、3)中，将芯片取出置于洁净的孔板中，在芯片上加入35μl edc和20μl sulfo-nhs溶液，分别含有0.609mg edc和0.348mg sulfo-nhs，溶剂为mes缓冲液中(0.05m、ph＝6)，避光孵育30min；
31、4)中，孵育完成后，加入500μl pbs缓冲液对芯片进行洗涤，重复洗涤2次，取出芯片自然风干；
32、5)中，将风干芯片置于新的孔板中，并在芯片上加入50μl，总计1-10μg的vimentin抗体(2μg抗体先溶于50μl mes缓冲液中(0.05m、ph＝6)，37℃孵育2h；
33、6)中，孵育完成后加入500μl pbs对芯片进行洗涤，每次1min，重复洗涤2次；
34、7)中500μl 1％bsa溶液，孵育1h；
35、8)中，孵育完成后加入500μl pbs对芯片进行洗涤，每次1min，重复洗涤2次；
36、9)中，将芯片置于1ml pbs保存备用。
37、优选的，所述步骤s3中，(1)中，细胞培养基包括mem培养基、10％胎牛血清、1％双抗。
38、优选的，所述步骤s3中，(1)中，培养条件为5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述金属筛网芯片的直径为8.8mm，孔径为18*18μm，所述金属筛网芯片镀的惰性金属为金、银、铂中的一种；将芯片置于无水乙醇中浸泡时间为2min；在烧杯中依次加入去离子水，氨水和双氧水，并放入油浴锅加热，然后将芯片置于烧杯中加热；将金属筛网芯片置于烧杯中加热的时间为5min；加热完成后，把芯片依次置于去离子水、无水乙醇、无水乙醇中清洗；使用氮气枪对芯片进行干燥。
3.根据权利要求1所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤S2中，1)中，取3mL巯基化透明质酸钠(HA-SH)加入5mL EP管中，随后向EP管内加入金属筛网芯片，振荡器上以200rpm共混孵育2h；
4.根据权利要求1所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤S3中，(1)中，细胞培养基包括MEM培养基、10％胎牛血清、1％双抗。
5.根据权利要求4所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其
6.根据权利要求5所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤S3中，(2)中，将50个Hela细胞置于300μLPBS中混合备用。
7.根据权利要求5所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤S4，对间质化细胞捕获的过程为：
...【技术特征摘要】
1.一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤s1中，所述金属筛网芯片的直径为8.8mm，孔径为18*18μm，所述金属筛网芯片镀的惰性金属为金、银、铂中的一种；将芯片置于无水乙醇中浸泡时间为2min；在烧杯中依次加入去离子水，氨水和双氧水，并放入油浴锅加热，然后将芯片置于烧杯中加热；将金属筛网芯片置于烧杯中加热的时间为5min；加热完成后，把芯片依次置于去离子水、无水乙醇、无水乙醇中清洗；使用氮气枪对芯片进行干燥。
3.根据权利要求1所述的一种间质型循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述步骤s2中，1)中，取3ml巯基化透明质酸钠(ha-sh)加入5ml ep管中，随后向...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜菁，王伟，
申请(专利权)人：江苏汇先医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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