【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织工程和类器官芯片，特别涉及一种高通量血管化肝脏类器官模型及其构建方法。
技术介绍
1、自2013年，hans clevers等人首次对人肝脏类器官(human liver organoids,hlos)进行报道以来，肝类器官因在体外建模和药物筛选方面的优势，得以迅速发展。目前，人源肝脏类器官的种子细胞主要包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞和原代细胞，其构建的手段也多种多样(包括传统胶滴法、基于三维支架及多孔阵列等)。随着这些技术的发展，使得体外构建肝脏类器官支持重塑体内肝脏的部分生理及病理特征。除了作为肝脏发育研究工具，肝脏类器官现已被用于研究病毒、酒精、药物、遗传因素、代谢等因素引起的肝脏相关疾病。利用疾病诱发因素定向诱导正常肝脏类器官病变，以研究疾病的发生发展；病人特异性细胞组织来源构建肝脏类器官维持体内相似表型，以研究疾病的病理特征或用于药物开发和筛选平台、毒性测试工具以及针对患者的治疗设计。最为重要的是，肝脏类器官支持冷冻保存，为构建的生物样本库提供了机会。
2、虽然，肝脏类器官模型的结构复杂性较以往体外模型有所提高，但仍不能完全重塑人类肝脏的细胞类型和功能复杂性。目前报道的大多数方法构建的肝脏类器官主要包含肝实质细胞，缺乏成熟内皮细胞、成纤维细胞等非实质细胞类型。事实上，肝脏是一个高度血管化的器官，肝窦内皮细胞是其中第二大细胞成分，约占非实质细胞群的70％。在肝脏发育过程中，内皮细胞与肝实质细胞特定的信号排列是诱导肝芽发生、生长和迁移必不可少的环节；随之，内皮细胞形成灌注的毛细血管网，进一步促
3、因此，为了克服上述培养方法存在的问题，急需开发一种高通量血管化肝脏类器官的培养芯片及血管化的肝脏类器官的方法，无需添加内皮相关培养基及基质胶成分，实现内胚层和中胚层共分化的血管化肝脏类器官的构建条件，适用于大规模构建均一的血管化肝脏类器官，对于构建更加仿生的肝脏体外模型提供了方法支持，促进血管化类器官更广泛应用于未来的治疗等具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种高通量血管化肝脏类器官模型和构建方法，上下储液通孔的中间设有多孔薄膜和穿孔微阵列培养层，这种设计方式有利于芯片上下层液体进行交换，以促进微孔阵列中形成涡流，以促进流体在类器官表面的产生，通过流体刺激促进血管网络自发生成，进而得到血管化肝脏类器官模型。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，所述方法包括：
4、获得高通量血管化肝脏类器官培养芯片，包括：细胞培养板和设于所述细胞培养板内的集成式微孔组件，所述集成式微孔组件从下到上依次包括：
5、下储液层，具有下层通孔；
6、多孔薄膜层，设于所述下储液层的中部上表面，所述多孔薄膜层表面分布有微纳尺寸的孔，用于上下储液池流体交换；
7、穿孔微阵列培养层，具有多个均匀分布穿孔微孔，用于血管化肝脏类器官培养；每个微孔的深度为0.5mm～5mm，相邻两个所述微孔之间距离为10μm～1mm，微孔的倾斜角在30°～90°之间；
8、上储液层，具有两个侧培养基储液通孔和中间培养基储液通孔，所述两个侧培养基储液通孔和所述下储液层的所述下层通孔相连通形成培养基灌流通道，所述穿孔微阵列培养层和所述多孔薄膜层设于所述中间培养基储液通孔的底部，构成血管化肝脏类器官培养腔室；
9、获得前肠胚细胞并消化成单个前肠细胞；
10、将所述单个前肠胚细胞接种至所述高通量血管化肝脏类器官培养芯片的所述穿孔微阵列培养层中培养，获得肝脏类器官；后置于流体剪切力装置上进行动态培养，得到所述血管化肝脏类器官。
11、在本专利技术的第二方面，提供了一种采用所述方法制备得到的高通量血管化肝脏类器官模型。
12、在本专利技术的第三方面，提供了一种高通量血管化肝脏类器官培养芯片，包括：
13、细胞培养板；
14、设于所述细胞培养板内的集成式微孔组件，所述集成式微孔组件从下到上依次包括：
15、下储液层，具有培养基储液通孔；
16、多孔薄膜层，设于所述下储液层的中部上表面，所述多孔薄膜层表面分布有微纳尺寸的孔，用于上下储液池流体交换；
17、穿孔微阵列培养层，具有多个均匀分布穿孔微孔，用于血管化肝脏类器官培养；每个微孔的深度为0.5mm～5mm，相邻两个所述微孔之间距离为10μm～1mm，微孔的倾斜角在30°～90°之间；
18、上储液层，具有两个侧培养基储液通孔和中间培养基储液通孔，所述两个侧培养基储液通孔和所述下储液层的所述培养基储液通孔相连通形成培养基灌流通道，所述穿孔微阵列培养层和所述多孔薄膜层置于所述中间培养基储液通孔的底部，构成血管化肝脏类器官培养腔室。
19、进一步地，，所述上储液层的高度为2～20mm；所述储液层的高度为0.2～5mm；所述多孔膜的厚度为5～20μm，孔隙大小为0.1～8μm，孔隙率为1×105～4×108孔/cm2。
20、在本专利技术的第四方面，提供了所述的高通量血管化肝脏类器官模型在器官移植领域、胆管损伤的修复及治疗或再生医学及疾病研究中应用。
21、本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
22、(1)本专利技术提供的高通量血管化肝脏类器官的培养芯片具有上下双层流体储液结构，中间有多孔薄膜分隔，允许上下层液体的交换。此结构设计较单层微孔阵列设计相比，能够均一的在微孔阵列中的每个微孔内部形成涡流，以促进流体在每个微孔中的类器官的表面产生，通过流体刺激促进血管网络自发生成，而传统单层微孔阵列设计无法实现。
23、(2)本专利技术提供的高通量血管化肝脏类器官的培养芯片可以根据具体需求进行设计和定制，适配于多种市售培养皿，满足使用与不同的实验通量需求。
24、(3)本专利技术提供的高通量血管化肝脏类器官的培养芯片为开放式设计，便于类器官培养操作、培养基的收集、类器官取出进行后续的多手段分析。
25、(4)本专利技术完全基于肝脏类器官分化培养体系，无需额外引入内皮相关培养基及基质胶成分，利于降低类器官本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述下储液层的高度为0.2～5mm。
3.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述薄膜层为多孔膜，包括PDMS、PMMA、PC、PI或PET中的至少一种，所述多孔膜的孔隙大小为0.1～8μm，孔隙率为1×105～4×108孔/cm2，厚度为5～20μm。
4.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述前肠胚细胞选自人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞分化的前肠胚细胞、冻存的人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞分化的前肠胚细胞中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述接种的前肠胚细胞的密度为50～400细胞/孔。
6.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述动态培养的条件包括：在培养环境中以1.0×10-6～5.0×10
7.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述单个前肠胚细胞接种至所述高通量血管化肝脏类器官培养芯片的所述穿孔微阵列培养层中培养的时间为8～14天，得到边界清晰的肝脏类器官；所述动态培养的时间为6～10天，得到具有微血管的肝脏类器官。
8.一种采用权利要求1-7任一项所述方法制备得到的高通量血管化肝脏类器官模型。
9.一种权利要求1中的高通量血管化肝脏类器官培养芯片，其特征在于，所述高通量血管化肝脏类器官培养芯片包括：
10.权利要求8所述的高通量血管化肝脏类器官模型在器官移植领域、胆管损伤的修复及治疗或再生医学及疾病研究中应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述下储液层的高度为0.2～5mm。
3.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述薄膜层为多孔膜，包括pdms、pmma、pc、pi或pet中的至少一种，所述多孔膜的孔隙大小为0.1～8μm，孔隙率为1×105～4×108孔/cm2，厚度为5～20μm。
4.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述前肠胚细胞选自人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞分化的前肠胚细胞、冻存的人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞分化的前肠胚细胞中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种高通量血管化肝脏类器官模型的构建方法，其特征在于，所述接种的前肠胚细胞的密度为50～400...
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