【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及定量蛋白质组学测定，尤其涉及一种细胞内蛋白质折叠状态的测定方法。
技术介绍
1、蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指多肽链中所有原子和基团的构象。它是在二级结构的基础上进一步盘曲折叠形成的，包括所有主链和侧链的结构。由于蛋白质异常的三维空间结构可以引发多种“折叠病”，如疯牛病、亨廷顿舞蹈症、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、肿瘤、白内障等等。因此，“蛋白质折叠”问题被生物科学家列为“21世纪生物物理学”的重要前沿课题。随着实验技术的快速发展，过去难以在分子水平上的生命活动研究得以开展。核磁共振技术(nmr)可在秒到皮秒的时间域上观察不同温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程，其中包括主链和侧链的运动，然而nmr仍然存在着核磁信号峰重叠严重、谱线较宽、分辨率较低、质量较大的蛋白质复合物分析困难、所需蛋白量大等问题；冷冻电镜虽然以较高的分辨率直接分析蛋白质复合物的精细结构，可是存在着仪器价格昂贵、表征通量低等不足；氢氘交换质谱可在单个氨基酸分辨率水平上监测蛋白质的结构及其动态变化，是研究蛋白质折叠的一种有效方法，其主要缺点是在蛋白质酶解、多肽的色谱分离等样品处理过程中存在氢氘回交现象，使质谱数据分析变得复杂化。况且，这些方法并不能在细胞内检测蛋白质的折叠变化。虽然荧光共振能量转移可在细胞内监测不同荧光标记蛋白质的相互作用及其动态变化，但是其缺点是通量低，需要标记可能对蛋白质折叠有影响的荧光素基团。
2、蛋白质折叠机制的解析有助于阐明蛋白质错误折叠引起的疾
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种细胞内蛋白质折叠状态的测定方法，方法简单快速，不需要对蛋白进行纯化或荧光标记，即可实现细胞内大规模蛋白质折叠状态的质谱测定。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种细胞内蛋白质折叠状态的测定方法，包括以下步骤：
4、(1)收集细胞，经液氮冷冻后加入非特异性酶，研磨后离心得到酶解液，同时以不加入非特异性酶的细胞作为对照；
5、(2)取步骤(1)的酶解液，与尿素溶液混合后离心、过滤，收集蛋白质和滤液；
6、(3)将步骤(2)中获得的蛋白质进行二次酶解后收集多肽，并对多肽进行标记定量或无标记定量；
7、(4)将步骤(2)的滤液和步骤(3)的多肽色谱分离后，分别进行质谱分析，得到高分辨总离子流色谱图，为质谱数据；
8、(5)将步骤(4)得到的质谱数据使用搜库软件进行处理，其中步骤(2)的滤液质谱数据使用非特异性酶搜索，步骤(3)的多肽质谱数据使用特异性酶切搜索；
9、(6)将特异性酶切搜索所得的多肽质谱结果归类于蛋白质的结构域，计算蛋白质的折叠组分；根据非特异性酶搜索所得的多肽结果，归类于蛋白质的结构域，分析蛋白质的未折叠区域；
10、所述细胞包括哺乳细胞、细菌、真菌。
11、优选的，所述非特异性酶包括嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶k。
12、优选的，所述非特异性酶与细胞的质量比为1:5～50。
13、优选的，所述标记定量采用silac、tmt或itraq。
14、优选的，所述二次酶解使用的酶包括胰蛋白酶。
15、优选的，二次酶解时使用的酶与所述蛋白质的质量比为1:45～55，酶解时间为10～15h。
16、优选的，所述尿素溶液中尿素的浓度为7～9m。
17、优选的，步骤(2)中的酶解液和尿素溶液的质量体积比为25～100μg:200μl。
18、优选的，所述除盐的方法为c18滤膜除盐。
19、优选的，所述质谱的分析模式包括数据依赖型采集或数据非依赖型采集。
20、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的测定方法简单快速，不需要对蛋白进行纯化、或荧光标记，即可实现细胞内大规模蛋白质折叠状态的质谱测定，在蛋白质错误折叠引起的疾病和药物筛选中具有良好的应用空间和潜力。
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1.一种细胞内蛋白质折叠状态的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述非特异性酶包括嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶K。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述非特异性酶与细胞的质量比为1:5～50。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述标记定量采用SILAC、TMT或iTRAQ。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述二次酶解使用的酶包括胰蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，二次酶解时使用的酶与所述蛋白质的质量比为1:45～55，酶解时间为10～15h。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述尿素溶液中尿素的浓度为7～9M。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中的酶解液和尿素溶液的质量体积比为25～100μg:200μL。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述除盐的方法为C18滤膜除盐。
10.根据权利要求1所述的测
...【技术特征摘要】
1.一种细胞内蛋白质折叠状态的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述非特异性酶包括嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶k。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述非特异性酶与细胞的质量比为1:5～50。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述标记定量采用silac、tmt或itraq。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述二次酶解使用的酶包括胰蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的测定方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵樑，赵婷，孙振兴，马拯，
申请(专利权)人：天津市肿瘤医院天津医科大学肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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