【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种由几丁质酶vhchit2和几丁质脱乙酰酶rscda1组成的双功能融合蛋白及其对几丁质和虾壳的水解作用。
技术介绍
1、几丁质是自然界除纤维素外第二多的多糖化合物，主要存在于虾、蟹等的外壳中。然而，几丁质高度的晶体结构，使其不溶于水、稀酸和稀碱中，目前仍然是一种难以被开发利用的天然大分子。与几丁质相比，其衍生物壳寡糖具有较低的分子量、较高的脱乙酰度，使其在水中的溶解性大幅度提高。有研究表明，壳寡糖表现出较多的生物活性，如抗菌、抗氧化、抗炎、抗高血压及药物传递能力、抗糖尿病、抗肥胖、抗阿尔兹海默症、降低胆固醇、止血作用等，在功能性食品、果蔬保鲜、医药等方面有广泛的应用。
2、几丁质经脱乙酰作用生成壳聚糖，再进行降解可制备壳寡糖。化学法制备壳寡糖需要先采用naoh对几丁质进行脱乙酰，再采用hcl进行进一步的降解。强酸强碱的使用对环境造成污染，而且对壳寡糖理化特性也可能产生不利的影响。采用酶法制备壳寡糖不仅对环境较友好，且反应的可预测性和可控性要优于化学法。几丁质酶和几丁质脱乙酰酶是几丁质生物转化为壳寡糖的关键酶。由于几丁质的高度结晶使其与酶的亲和性较差，目前已报道的几丁质酶和几丁质脱乙酰酶活性普遍较低，尤其是几丁质脱乙酰酶，仅能脱去几丁质中极少量的乙酰基，无法应用于大规模的工业化生产中；而且，由于几丁质生物转化为壳寡糖需要几丁质酶和几丁质脱乙酰酶的共同作用，两步酶解法的工艺比较繁琐复杂，生产成本较高。与几丁质脱乙酰酶相比，几丁质酶对几丁质的水解作用较强，构建由几丁质酶和几丁质脱乙酰酶组成
3、目前，还未见关于由几丁质酶vhchit2和几丁质脱乙酰酶rscda1组成的双功能融合蛋白的报道。
技术实现思路
1、针对现有的几丁质酶和几丁质脱乙酰酶对几丁质的催化活性低且酶法制备壳寡糖工艺复杂的问题，本专利技术的主要目的是构建一种由几丁质酶和几丁质脱乙酰酶组成的融合蛋白，酶稳定性高于亲本酶，且对几丁质和虾壳粉的水解效率提高。
2、为实现上述目的，采用以下技术方案：一种双功能融合蛋白，利用基因工程手段构建由几丁质酶vhchit2和几丁质脱乙酰酶rscda1通过一段连接肽连接而成的双功能融合蛋白rv1。
3、进一步地，所述几丁质酶vhchit2来源于哈维氏弧菌，其氨基酸序列如seq id no:1所示，几丁质脱乙酰酶rscda1来源于匍枝根霉，其氨基酸序列如seq id no:2所示，连接肽的氨基酸序列为ggggs-(xp)2，几丁质酶vhchit2，其核苷酸序列如seq id no:3所示，几丁质脱乙酰酶rscda1，其核苷酸序列如seq id no:4所示，连接肽的核苷酸序列为ggaggtggaggttctaagccaaagcca。
4、本专利技术另一目的在于提供一种融合基因，其含有所述的几丁质酶vhchit2基因序列、几丁质脱乙酰酶rscda1的基因序列和连接序列ggaggtggaggttctaagccaaagcca。
5、本专利技术另一目的在于提供一种重组载体，其含有所述的融合基因序列。
6、本专利技术另一目的在于提供一种重组菌，其含有所述的重组载体。
7、本专利技术另一目的在于提供一种双功能融合蛋白rv1的构建方法，包括以下步骤：
8、(1)融合基因的克隆
9、(1-1)分别对几丁质酶vhchit2和几丁质脱乙酰酶rscda1进行pcr扩增，并回收pcr产物；
10、(1-2)以vhchit2和rscda1的pcr产物为模板，两者摩尔浓度比为1：1，添加引物后利用重叠延伸pcr技术，通过一段连接序列ggaggtggaggttctaagccaaagcca将vhchit2和rscda1连接而成，再回收pcr产物，获得融合基因片段；
11、(2)构建重组载体
12、(2-1)表达载体为质粒ppic9k，将带有snabi和noti酶切位点的融合基因片段和质粒ppic9k分别经snabi和noti酶切后，按照摩尔浓度比10：1的比例进行连接；将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，筛选含有融合基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证；
13、(3)将所述重组表达载体转化至感受态细胞中
14、(3-1)将重组表达载体通过内切酶saci线性化后通过电转化法转入细胞毕赤酵母gs115；
15、(4)对含有vhchit2和rscda1的融合蛋白rv1进行发酵诱导(4-1)将重组菌毕赤酵母gs115接种至bmmy培养基中，发酵诱导融合蛋白rv1的表达；
16、(5)对融合蛋白rv1进行纯化
17、(5-1)采用组氨酸标签纯化试剂盒纯化融合蛋白rv1。
18、进一步地，步骤(1-1)vhchit2进行pcr扩增的正向引物为fs-5f(aggtggaggttctaagccaaagccagctccaaccgcaccaag)，反向引物为vh2’-r(aaggcgaattaattcgcggccgcgttacagttagatggaccaa c)；rscda1进行pcr扩增的正向引物为rs1-f(agagaggctgaagcttacgtaatgcatgacaaaaaagaagc)，反向引物为fs-6r(gctttggcttagaacctccacctccagcaatagccaacccgag)。
19、进一步的，步骤(1-2)vhchit2和rscda1进行重叠延伸pcr的正向引物为rs1-f，反向引物为vh2’-r。
20、进一步地，步骤(1-2)重叠延伸pcr分为两个步骤：(1)两个基因的连接，5个循环，退火温度为62～58℃，每完成一个循环后，touchdown pcr的退火温度降低1℃；(2)25个循环，融合产物的积累，退火温度为55℃；pcr反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，退火5s，72℃延伸3.5min，共30个循环，最后再72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物是是否有目的基因，目的基因含有vhchit2基因序列、rscda1基因序列和连接序列ggaggtggaggttctaagccaaagcca，目的条带大约3500bp。
21、进一步地，所述rv1的几丁质酶最适温度为50℃，rv1的几丁质脱乙酰酶最适温度为50℃；rv1的几丁质酶最适ph为7.0，几丁质脱乙酰酶最适ph为6.5。
22、本专利技术另一目的在于提供所述的双功能融合蛋白rv1在几丁质和虾壳粉水解中的应用。
23、进一步地，所述几丁质来源于虾、蟹壳；虾壳的制备方法为：将南美白对虾冷冻虾壳洗净后晒干，再研磨成颗粒大小为0.25～0.425μm的虾壳粉。
24、进一步地，融合蛋白rv1对几丁质和虾壳粉的水解度分别达到19.0％和32.2％；水解本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于：几丁质酶VhChit2和几丁质脱乙酰酶RsCDA1通过一段连接肽连接而成的双功能融合蛋白RV1。
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于：所述几丁质酶VhChit2来源于哈维氏弧菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，几丁质脱乙酰酶RsCDA1来源于匍枝根霉，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，连接肽的氨基酸序列为GGGGS-(XP)2，几丁质酶VhChit2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，几丁质脱乙酰酶RsCDA1，其核苷酸序列如SEQID NO:4所示，连接肽的核苷酸序列为GGAGGTGGAGGTTCTAAGCCAAAGCCA。
3.一种融合基因，其含有权利要求2所述的几丁质酶VhChit2基因序列、几丁质脱乙酰酶RsCDA1基因序列和连接序列GGAGGTGGAGGTTCTAAGCCAAAGCCA。
4.一种双功能融合蛋白RV1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白RV1的构建方法，其特征在于，步骤(1-1)VhChi
6.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白RV1的构建方法，其特征在于，步骤(1-2)VhChit2和RsCDA1进行重叠延伸PCR的正向引物为Rs1-F，反向引物为Vh2’-R。
7.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白RV1的构建方法，其特征在于，步骤(1-2)重叠延伸PCR分为两个步骤：(1)两个基因的连接，5个循环，退火温度为62～58℃，每完成一个循环后，Touchdown PCR的退火温度降低1℃；(2)25个循环，融合产物的积累，退火温度为55℃；PCR反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，退火5s，72℃延伸3.5min，共30个循环，最后再72℃延伸10min；通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物是是否有目的基因，目的基因含有VhChit2基因序列、RsCDA1基因序列和连接序列GGAGGTGGAGGTTCTAAGCCAAAGCCA，目的条带大小3500bp。
8.根据权利要求7所述的双功能融合蛋白RV1的构建方法，其特征在于：所述RV1的几丁质酶最适温度为50℃，RV1的几丁质脱乙酰酶最适温度为50℃；RV1的几丁质酶最适pH为7.0，几丁质脱乙酰酶最适pH为6.5。
9.权利要求1-8任何一项所述的双功能融合蛋白RV1在几丁质和虾壳粉水解中的应用。
10.根据权利要求9所述的双功能融合蛋白RV1在几丁质和虾壳粉水解中的应用，其特征在于：所述几丁质来源于虾、蟹壳；虾壳的制备方法为：将南美白对虾冷冻虾壳洗净后晒干，再研磨成颗粒大小为0.25～0.425μm的虾壳粉；水解条件为：使用100U的融合蛋白RV1分别水解100mL的几丁质和虾壳粉悬浮液10mg/mL，50℃、pH 7.0条件下反应12h。
...【技术特征摘要】
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于：几丁质酶vhchit2和几丁质脱乙酰酶rscda1通过一段连接肽连接而成的双功能融合蛋白rv1。
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于：所述几丁质酶vhchit2来源于哈维氏弧菌，其氨基酸序列如seq id no:1所示，几丁质脱乙酰酶rscda1来源于匍枝根霉，其氨基酸序列如seq id no:2所示，连接肽的氨基酸序列为ggggs-(xp)2，几丁质酶vhchit2，其核苷酸序列如seq id no:3所示，几丁质脱乙酰酶rscda1，其核苷酸序列如seqid no:4所示，连接肽的核苷酸序列为ggaggtggaggttctaagccaaagcca。
3.一种融合基因，其含有权利要求2所述的几丁质酶vhchit2基因序列、几丁质脱乙酰酶rscda1基因序列和连接序列ggaggtggaggttctaagccaaagcca。
4.一种双功能融合蛋白rv1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白rv1的构建方法，其特征在于，步骤(1-1)vhchit2进行pcr扩增的正向引物为fs-5faggtggaggttctaagccaaagccagctccaaccgcaccaag，反向引物为vh2’-r aaggcgaattaattcgcggccgcgttacagttagatggaccaac；rscda1进行pcr扩增的正向引物为rs1-fagagaggctgaagcttacgtaatgcatgacaaaaaagaagc，反向引物为fs-6r gctttggcttagaacctccacctccagcaatagccaacccgag。
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