【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为叶螨abc转运蛋白亚家族abce-f基因及其dsrna杀螨效应。
技术介绍
1、农业害螨属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨亚纲，真螨目的小型及微型动物，广泛分布于各种农林作物上，是当今世界农林作物上的主要害虫。
2、近年来害螨的危害越来越严重，长期使用化学防治对环境已构成威胁，使防治工作难上加难，因此，研究工作者需要寻找新的防控方向，达到害虫治理工作与环境保护的和谐发展，本专利技术采用rna干扰技术，对叶螨abce-f基因的表达进行干扰(沉默)，探究沉默叶螨abce-f基因后对叶螨的致死率，对卵的正常孵化和幼螨生长发育的影响，以期探寻新的害螨控制方法。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术公开了叶螨abc转运蛋白亚家族abce-f基因及其dsrna杀螨效应，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：叶螨abc转运蛋白亚家族abce-f基因及其dsrna杀螨效应；abce-f基因的提取步骤如下；
5、s1、叶螨总rna提取及cdna合成
6、选用叶螨雌成螨600头，于1.5mlrnasefree离心管中充分研磨，按照lifetechnologies公司puerlinktmrnaminikit试剂盒说明书提取总rna，用takara公司的反转录试剂盒primescriptrt-pcrkit反
7、s2、叶螨abce转运蛋白基因片段的克隆
8、根据测序后得到的abce-f的mrna序列，采用primer5.0软件分别设计叶螨abce-f特异性引物：
9、abce-f1：atggcaggtcgtggtccagct
10、abce-r1：ttaaagatcgtccaagaaa
11、abcf1-f：atgtcaaaaactgaagacatt
12、abcf1-r：tcattcaggtctggcattttct
13、abcf2-f：atgtctgatcgaaagacaa
14、abcf2-r：ttaaatggcaccagct
15、abcf3-f：atgtcaaaaactgaagacatt
16、abcf3-r：ttatttaacatcctctaattctt
17、以cdna为模板采用常规pcr进行扩增反应体系同上，扩增条件为：
18、95℃预变形3min；
19、94℃30s，t1℃45s，72℃90s，运行5个循环；
20、94℃30s，t2℃45s，72℃90s，运行30个循环；总计35个循环；
21、72℃10min；4℃保存；
22、注：t1，t2是根据引物的tm值的不同而定的；
23、对pcr产物进行1％凝胶电泳检测、回收、连接、转化、测序；
24、s3、叶螨abce转运蛋白基因序列分析及进化树构建
25、利用orcae分析获得的cdna序列的开放阅读框及蛋白质翻译情况；使用expasy中protparam软件分析abc转运蛋白基因编码的氨基酸序列组成；利用netphos3.0server程序的磷酸化位点分析功能预测蛋白序列中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种氨基酸残基可能的磷酸化位点；用dnaman进行氨基酸序列比对；利用mega5.0邻位相接法(nj)进行重复分析构建系统发育树；
26、s4、叶螨abc基因dsrna体外合成
27、使用primer5.0分别设计abce-f基因的双链rna(dsrna)合成引物，以含有abc基因的pcr产物为模板，用已合成的叶螨abc基因dsrna合成引物进行pcr扩增，生成合成dsrna的模板；
28、反应体系如下：
29、
30、扩增条件：
31、94℃预变性1min；
32、94℃30s，65℃30s，72℃40s，5次循环；
33、94℃30s，68℃30s，72℃40s，30次循环，共35次循环；
34、72℃延伸l0min；4℃保存；
35、pcr产物检测：
36、取扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测；对凝胶产物进行回收纯化使所获产物满足进行dsrna体外合成的量；
37、按照体外dsrna合成试剂盒说明书，在0.2ml离心管中建立下列反应体系：
38、nuclease-freewater6μl
39、ntpbuffermix10μl
40、temeplate2μl
41、t7rnapolymerasemix2μl
42、total20μl
43、扩增条件为：37℃，2h。
44、优选的，通过特异性引物克隆，获得棉叶螨的三个abcf基因，分别为abcf1基因，abcf2基因和abcf3基因：其中abcf1基因全长为1839bp,编码的氨基酸序列为613a.a；abcf2基因全长1755bp,编码的氨基酸序列为585a.a；abcf3基因全长2157bp,编码的氨基酸序列为719a.a。
45、优选的，一、叶螨abce基因沉默后对存活率影响
46、为确定叶螨abc基因沉默后对存活率的影响，分别用不同浓度的dsrna-abce-f进行点滴，浓度设置为0.1ug/μl和1ug/μl，以ddh2o作为对照dsrna-nc；用0.1ug/μldsrna-abce点滴一周，从第三天开始存活率逐渐降低；用1ug/μldsrna-abce点滴一周，从第四天开始存活率显著降低，与ck相比差异显著；总体而言，高浓度(1ug/μl)dsrna-abce能显著降低叶螨的存活率(p＜0.05)。
47、二、dsrna-abcf1饲喂棉叶螨影响
48、0.1ug/ul浓度的dsrna-abcf1喂饲叶螨时，对叶螨存活率在前3天没有影响，从第4天开始跟对照组开始产生差别，最后可以得出0.1ug/ul浓度dsrna-abcf1对叶螨存活率有影响；
49、用1ug/ul浓度dsrna-abcf1饲喂叶螨一周时间时，从第4天开始，存活率与对照组相比显著降低，比0.1ug/ul浓度的dsrna-abcf1饲养时的差别还要大。可以得出1ug/ul浓度的dsrna-abcf1对叶螨存活率有显著的负面影响，浓度越大影响也会越大；
50、用0.1ug/ul浓度的dsrna-abcf2饲养棉叶螨一周，结果可以看到dsrna-abcf2饲喂叶螨的存活率跟对照组没有明显差别，从而可以得出0.1ug/ul浓度的dsrna-abcf1对叶螨存活率没有显著影响；
51、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.叶螨ABC转运蛋白亚家族ABCE-F基因，其特征在于：通过特异性引物克隆，获得棉叶螨的三个ABCF基因，分别为ABCF1基因，ABCF2基因和ABCF3基因：其中ABCF1基因全长为1839bp,编码的氨基酸序列为613a.a；ABCF2基因全长1755bp,编码的氨基酸序列为585a.a；ABCF3基因全长2157bp,编码的氨基酸序列为719a.a。
2.根据权利要求1任一项所述的叶螨ABC转运蛋白亚家族ABCE-F基因的dsRNA杀螨效应，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的叶螨ABC转运蛋白亚家族ABCE-F基因的dsRNA杀螨效应，其特征在于：分别测定不同dsRNA片段对叶螨存活、卵孵化和适合度的影响，结果表明：
【技术特征摘要】
1.叶螨abc转运蛋白亚家族abce-f基因，其特征在于：通过特异性引物克隆，获得棉叶螨的三个abcf基因，分别为abcf1基因，abcf2基因和abcf3基因：其中abcf1基因全长为1839bp,编码的氨基酸序列为613a.a；abcf2基因全长1755bp,编码的氨基酸序列为585a.a；abcf3基因全长2157bp,编...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵伊英，崔丹丹，王莎，王鑫磊，可汗·穆罕默德·阿斯凡迪亚尔，巴斯特·阿里，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：
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