【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于类器官培养，具体涉及一种宫颈鳞癌类器官培养基以及培养方法。
技术介绍
1、宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，是妇女癌症死亡的重要原因。2020年，全世界约有60.4万名妇女被诊断为宫颈癌，34.2万死于该疾病。鳞状细胞癌是主要的病理类型，占70％以上。目前，世界范围内通过接种hpv疫苗、定期进行宫颈细胞学涂片检查和hpv-dna检测等预防措施，使得宫颈癌能够早期发现和治疗。然而，在低收入地区，宫颈癌的发病率仍然很高。宫颈癌的研究依赖于数量有限的细胞系(如hela或caski)、异种移植动物模型等，它们经过多次传代和存在物种差异，在临床研究中的价值有限，无法在体外模拟肿瘤真实的病理生理状态。这导致基础实验研究的疗效无法在临床治疗中重现。
2、类器官是由(多能或成体)干细胞生长而成的3d细胞簇，并自发组织成器官样或组织样结构，这些结构富集了来源组织中典型存在的细胞类型。与传统的二维培养系统相比，三维类器官系统在基因和蛋白质表达、代谢功能和微观组织结构等方面更接近于原生组织或器官。在肿瘤研究中，类器官不仅能够反映来源肿瘤组织的结构和功能特点，而且在基因组水平上与来源组织保持高度相似，重现了肿瘤的特征，如拷贝数变异、复发性突变和肿瘤异质性等。即使经过长时间传代仍然能够保持遗传稳定性。因此，类器官作为小型化和简化的器官模型系统，在疾病建模、精准医疗、药物筛选方面取得了相当大的成功，为肿瘤研究提供了极具价值的病理模型。
3、发育生物学研究揭示了胚胎发育过程中细胞因子在不同阶段决定细胞命运。细胞在体内的行为依
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点和不足而提供一种宫颈鳞癌类器官培养基及其培养方法，以提高类器官分离培养的成功率和形成效率。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术体用了一种宫颈鳞癌类器官培养基，包括以下组分：基础培养基、hepes缓冲液、营养添加剂和特异性活性因子；所述特异性活性因子包括青霉素-链霉素、两性霉素b、noggin、烟酰胺、n-乙酰半胱氨酸、rock抑制剂、a83-01、fgf7、sb202190、egf、氢化可的松、胰岛素转铁蛋白硒its、jagged-1、pge2和mhy1485；所述营养添加剂包括glutamax、n2和b27。
4、本专利技术所述培养基中采用的n2可作为胎牛血清的替代因子，化学成分明确；its有助于营养物质的转运和抗氧化；jagged-1能够活化notch通路，促进肿瘤细胞恶性生物学行为；pge2能够增强肿瘤细胞的干性；mhy1485能够激活mtor信号通路，促进宫颈鳞癌细胞的代谢活动和增殖。由此，本专利技术通过去除宫颈鳞癌类器官形成的抑制因子，并添加上述多种促进宫颈癌发生和进展的信号分子作为宫颈鳞癌细胞培养基，有利于维持宫颈鳞癌细胞的生态位，有效促进宫颈鳞癌类器官的形成和生长。
5、优选地，所述宫颈鳞癌类器官培养基包括以下组分：基础培养基、8-12mm hepes缓冲液、0.5-1.5x glutamax、0.5-1％ n2、0.5-1.5x b27、0.5-1.5％青霉素-链霉素、0.5-1.5％两性霉素b、0.5-1％ noggin、1-2.5mm烟酰胺、0.5-1.25mm n-乙酰半胱氨酸、8-12μmrock抑制剂、200-500nm a83-01、10-25ng/ml fgf7、0.1-1μm sb202190、200-500μg/mlegf、100-250μg/ml氢化可的松、0.5-1％胰岛素转铁蛋白硒its、0.1-1μm jagged-1、0.1-1μm pge2和0.5-2μm mhy1485。
6、更优选地，所述宫颈鳞癌类器官培养基包括以下组分：基础培养基、10mm hepes缓冲液、1x glutamax、1％ n2、1x b27、1％青霉素-链霉素、1％两性霉素b、1％ noggin、2.5mm烟酰胺、1.25mm n-乙酰半胱氨酸、10μm rock抑制剂、500nm a83-01、25ng/ml fgf7、1μmsb202190、500μg/ml egf、250μg/ml氢化可的松、1％胰岛素转铁蛋白硒its、μm jagged-1、1μm pge2和2μm mhy1485。
7、专利技术人经试验探究发现，所述宫颈鳞癌细胞培养基中各组分浓度采用上述更优选值时，能更有利于提高宫颈鳞癌类器官培养的成功率和效率。
8、优选地，所述基础培养基为dmem或dmem/f12。
9、优选地，所述宫颈鳞癌类器官培养基还包括以下组分：0.5-1.5％l-谷氨酸、0.5-1.5％l-丙氨酸或0.5-1.5％甘氨酸。
10、第二方面，本专利技术提供了一种宫颈鳞癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
11、(1)收集宫颈鳞状细胞癌组织，清洗去除血块和粘液，再将癌组织剪碎为细颗粒状；
12、(2)向剪碎的癌组织中加入含iv型胶原酶和edta的混合溶液，摇床消化10-15min，再静置1-3min，收集上清，然后用无血清培养液终止消化；
13、(3)将剩余的癌组织沉淀重复进行步骤(2)的消化和静置过程，收集上清并终止消化，直至癌组织呈现为粘液絮状为止；
14、(4)将重复收集的上清离心获得细胞沉淀，加入matrigel基质胶重悬，接种，固定，再加入上述的宫颈鳞癌类器官培养基，培养得到所述宫颈鳞癌类器官。
15、本专利技术所述的宫颈鳞癌类器官的培养方法采用消化后重复静置的方法收集宫颈鳞癌肿瘤细胞，能够获得更多分散的单个肿瘤细胞和肿瘤细胞团，大大提高了标本的利用率，从而经本专利技术所述宫颈鳞癌类器官培养基培养后能够获得更多数量的肿瘤类器官，明显提高宫颈鳞癌类器官培养的成功率和形成效率。
16、优选地，所述步骤(2)中，iv型胶原酶的浓度为1mg/ml，edta浓度为30nm。...
【技术保护点】
1.一种宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲液、营养添加剂和特异性活性因子；
2.根据权利要求1所述的宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、8-12mM HEPES缓冲液、0.5-1.5x Glutamax、0.5-1％N2、0.5-1.5xB27、0.5-1.5％青霉素-链霉素、0.5-1.5％两性霉素B、0.5-1％Noggin、1-2.5mM烟酰胺、0.5-1.25mM N-乙酰半胱氨酸、8-12μM ROCK抑制剂、200-500nM A83-01、10-25ng/ml FGF7、0.1-1μM SB202190、200-500μg/ml EGF、100-250μg/ml氢化可的松、0.5-1％胰岛素转铁蛋白硒ITS、0.1-1μMJagged-1、0.1-1μM PGE2和0.5-2μMMHY1485。
3.根据权利要求2所述的宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、10mM HEPES缓冲液、1x Glutamax、1％N2、1x B27、1％青霉素-链霉素、1％两
4.根据权利要求1所述的宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM或DMEM/F12。
5.根据权利要求1所述的宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，所述宫颈鳞癌类器官培养基还包括以下组分：0.5-1.5％L-谷氨酸、0.5-1.5％L-丙氨酸或0.5-1.5％甘氨酸。
6.一种宫颈鳞癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述混合溶液中的IV型胶原酶的浓度为0.5-1mg/ml，EDTA浓度为30-50nM。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中，细胞沉淀与Matrigel基质胶的体积比为1:2-1:3。
9.如权利要求1-5任一项所述的培养基在培养宫颈鳞癌类器官中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、hepes缓冲液、营养添加剂和特异性活性因子；
2.根据权利要求1所述的宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、8-12mm hepes缓冲液、0.5-1.5x glutamax、0.5-1％n2、0.5-1.5xb27、0.5-1.5％青霉素-链霉素、0.5-1.5％两性霉素b、0.5-1％noggin、1-2.5mm烟酰胺、0.5-1.25mm n-乙酰半胱氨酸、8-12μm rock抑制剂、200-500nm a83-01、10-25ng/ml fgf7、0.1-1μm sb202190、200-500μg/ml egf、100-250μg/ml氢化可的松、0.5-1％胰岛素转铁蛋白硒its、0.1-1μmjagged-1、0.1-1μm pge2和0.5-2μmmhy1485。
3.根据权利要求2所述的宫颈鳞癌类器官培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、10mm hepes缓冲液、1x glutamax、1％n2、1x b27、1％青霉素-链霉素、1％两性霉素b、1％noggin、2.5mm烟酰胺、1....
【专利技术属性】
技术研发人员：易笑，宋浩南，
申请(专利权)人：安徽黑豆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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