【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质组学研究方向鉴定氨基酸与定量分析氨基酸亲核反应活性，具体涉及一种在复杂蛋白质混合物溶液中特异性鉴定组氨酸并定量分析组氨酸亲核反应活性的方法。
技术介绍
1、原创药物的研制得益于新靶标的发现，而新靶标蛋白的发现依赖于高可信度、高通量的药物-蛋白质相互作用分析方法。蛋白质作为生命功能的执行者，其表达量、空间定位与结构差异直接影响药效的发挥。随着基因组和蛋白质组的发展，通过测序基因组学和蛋白质组学在人类蛋白质组中发现了超过20,000个蛋白质(文献1.oprea t i,bologa cg,brunak s,et al.unexplored therapeutic opportunities in the humangenome.nature reviews drug discovery,2018,17(5):317-332.)。然而，75％以上的蛋白质的功能尚未解析，主要原因是缺少药物分子靶向的空腔以及相应的亲核反应活性位点(文献2.spradlin j n,zhang e,nomura d k.reimagining druggability usingchemoproteomic platforms.accounts of chemical research,2021,54(7):1801-1813.)。因此，基于蛋白质组学层次实现对氨基酸亲核反应活性位点的表征成为原创药物设计的关键。
2、近年来，随着质谱技术的飞速发展，极大地推动了基于蛋白质组学技术的药物-靶蛋白相互作用研究。其中，基于活性的蛋
3、组氨酸在蛋白质中约占2％，是pka值唯一接近7的氨基酸，在生理环境中既能接受质子又能提供质子，发挥着质子传递的作用。组氨酸占据超过1/5人源酶活性中心，在蛋白质中发挥多重作用，包括与金属离子配位、质子受体和酸碱催化等。且有研究证明组氨酸的磷酸化修饰与哺乳动物中的恶性肿瘤密切相关(文献6.hindupur s k,colombi m,fuhs sr,et al.the protein histidine phosphatase lhpp is a tumour suppressor.nature,2018,555(7698):678-682.)。然而，由于缺乏可以在生理条件下标记组氨酸的化学探针，尚难以实现组氨酸活性的全局性表征。
4、为了解决上述方法的问题，我们利用丙烯醛(acr)的强亲电性，结合可逆的酰肼化学富集平台。发展了一种在生理条件下特异性鉴定组氨酸残基的化学蛋白质组学新方法，且在细胞裂解液等复杂蛋白质溶液中实现组氨酸亲核反应活性定量表征，为后续靶向组氨酸的共价偶联药物的开发提供了数据支持。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种在生理条件下特异性鉴定组氨酸和定量表征组氨酸亲核反应活性的新方法。
2、1.本专利技术提供的方法是基于α,β-不饱和烯醛试剂的强亲电性，筛选出对组氨酸高效标记的探针分子，在此基础上，利用可逆酰肼化学进行标记肽段的富集，在生理条件下实现组氨酸的高效富集与鉴定。并分别利用甲氧基羟胺(ch3-o-nh2)、氘甲氧基羟胺(cd3-o-nh2)引入同位素标记，从而定量表征组氨酸残基亲核反应活性，筛选出高反应性的组氨酸残基。
3、2.本专利技术采用如下技术方案：
4、(a)建立了基于α,β-不饱和烯醛的组氨酸标记策略，选择8种不同取代基的α,β-不饱和烯醛探针配成同一浓度，和蛋白提取物进行孵育。
5、(b)将n-乙基马来酰亚胺和蛋白提取物进行孵育，再加入丙烯醛探针进行孵育，有效克服了半胱氨酸等残基对标记和富集过程的干扰。实现了生理条件下组氨酸位点的高覆盖度标记与鉴定。
6、(c)孵育后的蛋白提取物进行丙酮沉淀，并进行蛋白质酶切，标记肽段富集和释放。
7、(d)取两组蛋白提取物，分别加入高低浓度的丙烯醛进行孵育。由甲氧羟胺和氘代甲氧羟胺引入同位素标记，定量分析组氨酸的亲核反应活性。
8、3.所述的蛋白质样品来源包括动物细胞蛋白提取物、动物组织蛋白提取物或其他蛋白提取物中的一种或两种以上。优选实验室可培养的动物癌细胞蛋白提取物。
9、4.所述的蛋白质提取物采用温和的方法提取细胞中的蛋白质，尽量保持蛋白质完整的天然结构，不能发生变性。优选以磷酸缓冲液(pbs)为细胞裂解液，用细胞破碎仪在冰上提取蛋白质。
10、5.所述的可富集的α,β-不饱和烯醛类化合物为双功能团的化学探针。一端是反应基团，可以与蛋白质上的一种或多种氨基酸(如：组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸等氨基酸)发生共价反应，另一端是富集基因，可以用于后续直接富集，被携带酰肼基团的固相富集材料捕获。
11、6.所述的可富集的α,β-不饱和烯醛类化合物包括丙烯醛，甲基丙烯醛，巴豆醛，反-2-甲基-2-丁烯本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性表征蛋白质中组氨酸亲核反应活性的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的步骤为：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求1或2或3或6所述的方法，其特征在于：
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：用于生理条件下蛋白质中组氨酸亲核反应活性的表征，通过高、低浓度烯醛探针的标记、富集和标记肽段的定量分析，进行蛋白质中组氨酸残基的微环境分析，进而筛选具有高亲核反应活性的组氨酸残基和相应的蛋白，实现细胞或组织等复杂生物样品中组氨酸亲核反应活性位点的表征。
【技术特征摘要】
1.一种特异性表征蛋白质中组氨酸亲核反应活性的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的步骤为：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求1或2...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶明亮，秦洪强，李佳颖，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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