【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程，更确切地说是一种p21特异性修饰的抗体及制备方法和应用。
技术介绍
1、在动物特别是人类的基因组中，p21、cdkl、p53、checkl、helb、atm等基因是维持遗传稳定的主要基因，它们的稳定表达对细胞的生长、维持和分化特别是肿瘤细胞的增殖，细胞周期调控等关键活动都启动至关重要的调控作用。
2、p21：该基因编码一种有效的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。编码的蛋白质结合并抑制细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶或细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活性，因此可作为 g1 细胞周期进程的调节剂。该基因的表达受肿瘤抑制蛋白 p53等上游转录因子的严格控制，该蛋白通过该蛋白介导 p53 依赖性细胞周期 g1 期停滞以响应各种应激刺激。该蛋白可与dna聚合酶辅助因子增殖细胞核抗原相互作用，在s期dna复制和dna损伤修复中发挥调节作用。目前发现，除了在转录水平被p53等关键分子调控外，还可以在翻译后水平，比如磷酸化，乙酰化或者泛素化等翻译后修饰调控。然而，p21在蛋白质水平被甲基化的翻译后修饰从未报道过，以邓振忠博士牵头的课题组在世界上首次报道了当p21可以被甲基化，具体而言，第156位精氨酸（r156）被蛋白质精氨酸甲基化转移酶prmt6甲基化（非对称性二甲基化）后，p21蛋白的细胞核转入细胞浆明显增加，最终促进肿瘤增殖，并导致化疗耐药。因此，该发现对于进一步深入研究p21的功能提供了全新的视角，特别是将来开发针对性的细胞周期调控的抗肿瘤药物提供了新的思路。
技术实现思
1、本专利技术的目的是提供一种p21特异性修饰的抗体及制备方法和应用，其可以用于针对性的细胞周期调控的抗肿瘤药物。
2、本专利技术采用以下技术方案：
3、p21特异性修饰的抗体的制备方法，包括以下步骤：
4、将抗原多肽与klh偶联，用于兔子免疫；
5、对兔子抗原注射进行免疫，取血，离心后取上清；
6、取阳性的血清进行纯化、富集并去除非特异性抗体；
7、所述抗原多肽包括非对称二甲基化修饰的cyhskr-(asy-2me)r-lifskr或dfyhskr-(asy-2me)r-lifskrc，对称二甲基化修饰多肽cyhskr-(sy-2me)r-lifskr，非修饰对照多肽 cyhskrrlifskr。
8、兔子免疫的具体步骤为：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，用注射器抽取抗原混合物，于兔子双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原；每个区域为1/4体积的免疫原。
9、兔子共免疫4次，分别在第1天，第21天 ，第28天，第35天。
10、纯化的具体步骤为：使用protein a亲和柱，将血清用过滤器进行过滤后，上样到平衡好的protein a层析柱上,为检测抗血清与填料的结合效率，需保留上样流出液，用pbs缓冲溶液清洗柱子，再用150 mm甘氨酸缓冲液进行洗脱。收集洗脱液，并加入中和缓冲溶液调制ph为7。
11、富集的具体步骤为：将protein a纯化后得到的粗纯igg上样到平衡好的抗原多肽亲和层析柱上进行富集。
12、除非特异性抗体的具体步骤为：将得到的抗体上样到平衡好的其他多肽亲和层析柱上，直接收集流出液，从而去除非特异性的抗体成分。
13、所述其他多肽为吡啶甲酰化修饰和异烟酸酰化修饰的多肽。
14、一种p21特异性修饰的抗体，通过上述制备方法得到。
15、一种p21特异性修饰的抗体的应用，用于针对性的细胞周期调控的抗肿瘤药物。
16、本专利技术的优点是：当p21被甲基化后（r156）促进了p21蛋白的细胞核转入细胞浆，细胞浆的p21增加后，导致肿瘤增殖及化疗耐药。
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1.p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的 p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，兔子免疫的具体步骤为：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1：1混合，抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，用注射器抽取抗原混合物，于兔子双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原；每个区域为1/4体积的免疫原。
3.根据权利要求1所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，兔子共免疫4次，分别在第1天，第21天 ，第28天，第35天。
4.根据权利要求1所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，纯化的具体步骤为：使用protein A亲和柱，将血清用过滤器进行过滤后，上样到平衡好的protein A层析柱上,为检测抗血清与填料的结合效率，需保留上样流出液，用PBS缓冲溶液清洗柱子，再用150 mM甘氨酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，并加入中和缓冲溶液调制pH为7。
5.根据权利要求1所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，富集的具体步骤为：将protein A纯化后得到的
6.根据权利要求5所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，除非特异性抗体的具体步骤为：将得到的抗体上样到平衡好的其他多肽亲和层析柱上，直接收集流出液，从而去除非特异性的抗体成分。
7.根据权利要求6所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，所述其他多肽为吡啶甲酰化修饰和异烟酸酰化修饰的多肽。
8.一种p21特异性修饰的抗体，其特征在于，其通过如权利要求1至7中任意一项所述的制备方法得到。
9.一种p21特异性修饰的抗体的应用，其特征在于，用于针对性的细胞周期调控的抗肿瘤药物。
...【技术特征摘要】
1.p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的 p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，兔子免疫的具体步骤为：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1：1混合，抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，用注射器抽取抗原混合物，于兔子双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原；每个区域为1/4体积的免疫原。
3.根据权利要求1所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，兔子共免疫4次，分别在第1天，第21天 ，第28天，第35天。
4.根据权利要求1所述的p21特异性修饰的抗体的制备方法，其特征在于，纯化的具体步骤为：使用protein a亲和柱，将血清用过滤器进行过滤后，上样到平衡好的protein a层析柱上,为检测抗血清与填料的结合效率，需保留上样流出液，用pbs缓冲溶液清洗柱子，再用150 mm甘氨酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓振忠，顾建春，章莉，邓丹，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：
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