【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及支原体检测，特别涉及基于lamp-crispr/cas12a的支原体广谱检测引物组合。
技术介绍
1、支原体属于柔膜菌纲，其细胞柔软，结构简单，具有多形性，直径为0.3-0.8μm，能够通过常用的直径为0.45μm的除菌滤膜，是目前发现的能够自我复制的最小微生物。2002年，drexler等学者对所检测的440个淋巴瘤细胞系进行支原体污染统计，仅有64%的细胞系是无支原体污染的。德国dsmz细胞库研究学者调查数据显示约1/4的细胞受到支原体污染的影响。支原体污染能够对科研或者生物制品的生产产生极大的影响，例如，使细胞代谢受阻，细胞形态发生改变，细胞信号通路发生改变，杂交瘤细胞融合受到抑制，抗支原体抗体代替单克隆抗体等，这些影响在生物制品的生产中往往是致命的。
2、鉴于支原体污染能够对生物制品的稳定性及安全性产生潜在的影响，各国相应的监管部门也对生物制品生产环节中的支原体污染控制做出一定的规定。中国药典3301支原体检测法指出主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（dna染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体；必要时，亦可釆用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。欧盟药典2.6.2章节，美国药典通则63和日本药典的g3章节也对生物制品支原体污染控制做出了规定。
3、随着生物制品种类的不断丰富，例如以基因治疗、细胞治疗和组织工程为基础的药物，此类药物保质期短，保存困难，需要更
4、环介导等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification，lamp）是一种常见的核酸扩增技术，该技术不需要热循环，不需要经过变性、退火和延伸阶段，能够在短时间内获得大量的目的产物。然而lamp技术在扩增时往往需要4-6种引物的参与，很容易出现非特异性扩增。单纯使用lamp扩增技术进行检测出现假阳性的概率较高。lamp扩增技术对扩增长度要求极高，单纯使用lamp扩增技术进行检测，灵敏度较低，其非特异性扩增也会影响检测灵敏度。当检测多种支原体时，引物设计的难度随检测对象数量增加而呈指数增加，引物之间相互干扰的可能性也会大大增加，即使使用专业软件辅助的设计，也无法解决上述问题，效果极差。这些问题都限制了其在广谱即时检测支原体中的运用。
5、crispr-cas12（clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，crisprs）系统是细菌与病毒斗争中进化出的一套自我保卫的系统，crispr/cas12蛋白家族在其特异性切割活性被激活时，其附带的非特异性切割活性也被激活，识别特异性极强，对靶标的切割效率极高，因此除了用来进行基因编辑外，在体外诊断方面也得到了广泛的运用。
6、现有技术中，中国专利申请cn105755161a公开了广谱检测支原体的lamp引物组，包括2个外引物，2个内引物和2个环引物。该专利以细胞培养过程中常见的8种支原体m.hyorhinis、m.fermentans、m.arginini、m.hominis、m.orale、m.salivarium、m.pirum、acholeplasmalaidlawii的its-23srrna序列，通过同源序列分析比对，找到特异性的保守靶基因片段（23s rrna序列5’端区域），使用primerexplorerv4在线设计获得了由2个外引物，2个内引物和2个环引物组成的lamp引物组合。经过分析比对，该专利申请虽然列举了多个支原体，但是该专利选取了部分支原体序列的保守区域，没有完全包含药典中规定的几种支原体的验证。这些支原体亲缘关系较近，在序列上都较为保守，检测结果容易出现相互干扰。该专利申请只进行了lamp扩增，没有和其他技术结合，灵敏度和覆盖度较低，在灵敏度上也并不符合各国药典的要求。
7、文献《检测肺炎支原体新方法的建立及应用》（周丽娟等，《实用临床医药杂志》，2022年第19期，100-104页）公开了将crispr⁃cas12a技术结合lamp单管一步法快速检测肺炎支原体，采用primer explorer version 5软件设计lamp引物，采用deskgen 软件设计crispr/cas12a crrna。该文献的样品来源为临床样本，无法对更加广泛的样品进行检测。该文献只设计了4条引物，缺少环引物，灵敏度也较差。
8、中国专利申请cn114410753a公开了以猪鼻支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、人型支原体、口腔支原体、唾液支原体、梨支原体、无胆甾支原体、无乳支原体、牛支原体、上颌支原体、关节炎支原体和肺支原体等的16s rrna序列使用snapgene软件比对共同保守序列后，获得的检测支原体的lamp引物组合。该专利使用的f/b引物通过ncbi网站中primer-blast搜索发现，其不存在扩增引物，理论上使用pcr技术都很难实现扩增，这对于lamp扩增技术而言难度极大；该专利申请只使用了一条环引物，理论上很难实现多种支原体的高灵敏度检测。
9、目前尚未见到有将lamp和crispr-cas12联合应用于多种支原体检测的即时技术。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题和技术空白，本专利进行了完善的专属性验证，不仅针对欧洲药典规定的需要验证的几种细菌进行了检测，还对常见的污染菌、真菌及生物制品常用细胞系进行了专属性的验证。这一点在其他专利文献中都没有数据支撑，尤其是药典规定的亲缘关系较近的几个菌种的验证。本专利在lamp扩增技术的基础上增加了基于cas核酸检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于LAMP-CRISPR/Cas12a的支原体广谱检测引物和crRNA的组合，其特征在于，包括2条外引物，5条内引物、4条环引物和crRNA，所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2所示，所述内引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-7所示，所述环引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.8-11所示；所述crRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12-15所示。
2.根据权利要求1所述的支原体广谱检测引物和crRNA的组合，其特征在于，制备所述crRNA的引物对为F1/R1、F2/R2、F3/R3和F4/R4，所述引物对F1/R1、F2/R2、F3/R3和F4/R4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16-23所示。
3.一种用于检测支原体的LAMP-CRISPR/Cas12a系统，其特征在于，所述LAMP-CRISPR/Cas12a系统包括SEQ ID NO.1、2所示的外引物，SEQ ID NO.3-7所示的内引物，SEQ IDNO.8-11所示的环引物的核苷酸序列；
4.根据权利要求3所述的LAMP-CRISPR/C
5.一种用于检测支原体的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求3或4所述的LAMP-CRISPR/Cas12a系统。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片。
7.一种不以疾病诊断和治疗为目的的检测支原体的方法，其特征在于，对供试品进行预处理，提取供试品的基因组，以所述基因组为模板进行扩增，以扩增产物为模板，利用权利要求3或4所述的LAMP-CRISPR/Cas12a系统，或者利用权利要求5或6所述的产品进行检测和结果判定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，检测方法为荧光法或侧向流法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，结果判定的方法为：当采用所述荧光法时，若供试品有明显的荧光增长曲线，且荧光值＞15cfu，可判定检测样本为支原体阳性，否则为阴性；当采用侧向流法时，若5min时的试纸条的检测线判读区有亮带，可判定检测样本为支原体阳性，否则为阴性。
...【技术特征摘要】
1.基于lamp-crispr/cas12a的支原体广谱检测引物和crrna的组合，其特征在于，包括2条外引物，5条内引物、4条环引物和crrna，所述外引物的核苷酸序列如seq id no.1、2所示，所述内引物的核苷酸序列如seq id no.3-7所示，所述环引物的核苷酸序列如seq idno.8-11所示；所述crrna的核苷酸序列分别如seq id no.12-15所示。
2.根据权利要求1所述的支原体广谱检测引物和crrna的组合，其特征在于，制备所述crrna的引物对为f1/r1、f2/r2、f3/r3和f4/r4，所述引物对f1/r1、f2/r2、f3/r3和f4/r4的核苷酸序列分别如seq id no.16-23所示。
3.一种用于检测支原体的lamp-crispr/cas12a系统，其特征在于，所述lamp-crispr/cas12a系统包括seq id no.1、2所示的外引物，seq id no.3-7所示的内引物，seq idno.8-11所示的环引物的核苷酸序列；
4.根据权利要求3所述的lamp-crispr/cas12a系统，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：臧照星，郝瑶，罗航，幸晓莹，徐国东，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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