【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术的领域涉及用于生物合成制备包括视黄醛、视黄醇以及视黄酯的一组维生素a(va)化合物的方法和工艺。更具体地说，本专利技术的方法和工艺包括那些利用微生物宿主细胞的方法和工艺，所述微生物宿主细胞已经过转化包括编码一组酶的异源核酸，该组酶包括新颖细菌视紫红质相关蛋白质样同源(blh)蛋白、视黄醛还原酶以及酰基转移酶。
技术介绍
1、维生素是我们的身体需要的物质并且必须定期从饮食中获得，其中维生素a是指一组不饱和类异戊二烯，包括视黄醛、视黄醇、视黄酸以及视黄酯，它们分别是维生素a的醛、醇、羧酸以及酯形式。最常见的视黄酯为乙酸视黄酯以及棕榈酸视黄酯，其结构为视黄醇分别连接至乙酸酯或棕榈酸酯(图1)。
2、维生素a在多种生理功能中发挥重要作用，如胚胎发育、成人生长和发育、眼睛发育和视觉、免疫系统维持以及上皮细胞分化。维生素a缺乏是儿童失明的主要原因并且与感染、皮肤以及甲状腺病症易发性增加相关。除用作营养补充物外，维生素a还作为动物饲料添加剂、抗衰老美容剂的原材料、用于改善皱纹的药剂以及用于皮肤病症的药物吸引了广泛关注。
3、估计到2021年，全世界维生素a市场规模为约86400万美元。目前，维生素a的化学合成为市场份额做出了重大贡献。维生素a的化学合成制备对于安全和可持续的制备来说并不理想，这带来了缺点，诸如因关键起始材料的成本而导致成本增加、毒性前体的使用、复杂的纯化过程、不希望的副产物的产生以及潜在原因的环境污染。
技术实现思路
1、在原核生物的
2、根据本公开，通过代谢工程化和发酵技术使用微生物细胞培养物(诸如产油酵母解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、面包酵母酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和/或谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum))可以可靠地以高产率产生视黄醛、视黄醇、乙酸视黄酯以及棕榈酸视黄酯。这些微生物细胞培养物可以有商业意义的产率从头合成“天然”视黄醛、视黄醇以及视黄酯。因此，本文提供的新的生物合成方法有助于形成一种非天然的方式来可持续地并且经济地产生天然来源的维生素a化合物，并且减轻维生素a化合物的化学合成制备的负担。
3、更具体地说，本公开涵盖用于通过微生物发酵来制造“天然”视黄醛、视黄醇、乙酸视黄酯以及棕榈酸视黄酯的方法和组合物，其中此类方法和组合物涉及用编码酶的一组异源核酸分子转化真核细胞，所述酶包括新颖细菌视紫红质相关蛋白质样同源(blh)蛋白、视黄醛还原酶以及酰基转移酶。
4、本公开部分基于以下发现：来源于基于视黄醛的光合微生物的某些blh蛋白可有效地催化β-胡萝卜素转化为视黄醛。与来源于真菌、细菌、藻类或动物的当前广泛使用的β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶相比，新发现的blh蛋白在异源宿主中展示更高的催化效率，从而可产生高含量的类视黄醇。通过将编码blh蛋白、视黄醛还原酶以及酰基转移酶的核酸分子的过表达与编码八氢番茄红素脱氢酶(carb)和双官能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carrp)的几种β-胡萝卜素生物合成基因以及编码融合蛋白(所述融合蛋白包含框内融合至香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)的法呢基二磷酸合酶(fpps))以及脂肪酸延长蛋白(elo1)的类胡萝卜素前体生物合成基因的过表达组合，通过提供与使用替代β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶的策略相比更高的效价可改善视黄醛、视黄醇以及视黄酯的产生。因此，本公开提供了没有与化学合成相关的缺点的用于产生“天然”维生素a化合物的经济并且可靠的方法。
5、在各种实施方案中，具有类胡萝卜素15,15'-裂解活性的酶可为细菌视紫红质相关蛋白质样同源(blh)蛋白或β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶(bcdo)。举例来说，酶可为sar116聚类α变形菌(proteobacterium)himb100β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶或其功能性变体。举例来说，酶可包含与seq id no:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，酶可包含seq id no:1的氨基酸序列。在其他实施方案中，酶可由seq id no:1的氨基酸序列组成。因此，核酸序列可包含与seq idno:2具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
6、在各种实施方案中，具有类胡萝卜素15,15'-裂解活性的酶可为细菌视紫红质相关蛋白质样同源(blh)蛋白或β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶(bcdo)。举例来说，酶可为δ变形菌门细菌(deltaproteobacteria bacterium)β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶或其功能性变体。举例来说，酶可包含与seq id no:3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，酶可包含seq id no:3的氨基酸序列。在其他实施方案中，酶可由seq id no:3的氨基酸序列组成。因此，核酸序列可包含与seq idno:4具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
7、在各种实施方案中，具有类胡萝卜素15,15'-裂解活性的酶可为细菌视紫红质相关蛋白质样同源(blh)蛋白或β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶(bcdo)。举例来说，酶可为sar116聚类细菌β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶或其功能性变体。举例来说，酶可包含与seqid no:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，酶可包含seq id no:5的氨基酸序列。在其他实施方案中，酶可由seq idno:5的氨基酸序列组成。因此，核酸序列可包含与seq id no:6具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
8、在各种实施方案中，具有类胡萝卜素15,15'-裂解活性的酶可为细菌视紫红质相关蛋白质样同源(blh)蛋白或β-胡萝卜素15,15'-双加氧酶(bcdo)。举例来说，酶可为α变形菌门细菌(alphaproteobacteria ba本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生维生素A化合物的方法，所述方法包括将包含β-胡萝卜素和细菌视紫红质相关蛋白质样同源物的第一反应混合物孵育足以产生视黄醛的时间。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌视紫红质相关蛋白质样同源物包含与SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43以及45中的任一者的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌视紫红质相关蛋白质样同源物包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43以及45中的任一者的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括将包含所述视黄醛和视黄醛还原酶的第二反应混合物孵育足以产生视黄醇的时间。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述视黄醛还原酶包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
6.如权利要求4或权
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，所述方法还包括将包含所述视黄醇和酰基转移酶的第三反应混合物孵育足以产生视黄酯的时间。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述酰基转移酶包含与SEQ ID NO:49、51、53、55以及57中的任一者的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
9.如权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述酰基转移酶包含SEQ ID NO:49、51、53、55以及57中的任一者的氨基酸序列。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述视黄酯包含乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯或它们的组合。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述视黄酯包含棕榈酸视黄酯。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第三反应混合物还包含脂肪酸延长蛋白1。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述脂肪酸延长蛋白1包含与SEQ ID NO:59至少85％同一的氨基酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述脂肪酸延长蛋白1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法还包括获得所述β-胡萝卜素。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述β-胡萝卜素通过将香叶基香叶基二磷酸(GGPP)与八氢番茄红素脱氢酶(CarB)和双官能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(CarRP)一起孵育来获得。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述GGPP经由甲羟戊酸途径从乙酰乙酰辅酶A获得，所述甲羟戊酸途径包含羟甲基戊二酰基辅酶A合酶(HMGS)、羟甲基戊二酰基辅酶A还原酶(HMGR)、异戊烯基二磷酸异构酶(IPI)、法呢基二磷酸合酶(FPPS)以及香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述GGPP经由甲羟戊酸途径从乙酰乙酰辅酶A获得，所述甲羟戊酸途径包含羟甲基戊二酰基辅酶A合酶(HMGS)、羟甲基戊二酰基辅酶A还原酶(HMGR)、异戊烯基二磷酸异构酶(IPI)以及包含融合至香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)的法呢基二磷酸合酶(FPPS)的融合酶。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法为体外方法。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法在宿主细胞中进行。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
22.如权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、藻类细胞或真菌细胞。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自耶氏酵母属；埃希氏杆菌属；沙门氏菌属；芽孢杆菌属；不动杆菌属；链霉菌属；棒杆菌属；甲基弯曲菌属；甲基单胞菌属；红球菌属；假单胞菌属；红杆菌属；集胞藻属；糖酵母属；接合酵母属；克鲁维酵母属；念珠菌属；汉逊酵母属；德巴利酵母属；毛霉属；毕赤酵母属；球拟酵母属；曲霉属；节丛孢属；短杆菌；微杆菌属；节杆菌属；柠檬酸杆菌属；克雷伯氏菌属；泛菌属；以及梭菌属。
24.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为解脂耶氏酵母。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞用编码细菌视紫红质相关蛋白质样同源物的核酸分...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种产生维生素a化合物的方法，所述方法包括将包含β-胡萝卜素和细菌视紫红质相关蛋白质样同源物的第一反应混合物孵育足以产生视黄醛的时间。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌视紫红质相关蛋白质样同源物包含与seqid no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43以及45中的任一者的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌视紫红质相关蛋白质样同源物包含seq id no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43以及45中的任一者的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括将包含所述视黄醛和视黄醛还原酶的第二反应混合物孵育足以产生视黄醇的时间。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述视黄醛还原酶包含与seq id no:47的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述视黄醛还原酶包含seq id no:47的氨基酸序列。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，所述方法还包括将包含所述视黄醇和酰基转移酶的第三反应混合物孵育足以产生视黄酯的时间。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述酰基转移酶包含与seq id no:49、51、53、55以及57中的任一者的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
9.如权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述酰基转移酶包含seq id no:49、51、53、55以及57中的任一者的氨基酸序列。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述视黄酯包含乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯或它们的组合。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述视黄酯包含棕榈酸视黄酯。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第三反应混合物还包含脂肪酸延长蛋白1。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述脂肪酸延长蛋白1包含与seq id no:59至少85％同一的氨基酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述脂肪酸延长蛋白1包含seq id no:59的氨基酸序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法还包括获得所述β-胡萝卜素。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述β-胡萝卜素通过将香叶基香叶基二磷酸(ggpp)与八氢番茄红素脱氢酶(carb)和双官能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carrp)一起孵育来获得。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述ggpp经由甲羟戊酸途径从乙酰乙酰辅酶a获得，所述甲羟戊酸途径包含羟甲基戊二酰基辅酶a合酶(hmgs)、羟甲基戊二酰基辅酶a还原酶(hmgr)、异戊烯基二磷酸异构酶(ipi)、法呢基二磷酸合酶(fpps)以及香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述ggpp经由甲羟戊酸途径从乙酰乙酰辅酶a获得，所述甲羟戊酸途径包含羟甲基戊二酰基辅酶a合酶(hmgs)、羟甲基戊二酰基辅酶a还原酶(hmgr)、异戊烯基二磷酸异构酶(ipi)以及包含融合至香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)的法呢基二磷酸合酶(fpps)的融合酶。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法为体外方法。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法在宿主细胞中进行。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
22.如权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、藻类细胞或真菌细胞。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自耶氏酵母属；埃希氏杆菌属；沙门氏菌属；芽孢杆菌属；不动杆菌属；链霉菌属；棒杆菌属；甲基弯曲菌属；甲基单胞菌属；红球菌属；假单胞菌属；红杆菌属；集胞藻属；糖酵母属；接合酵母属；克鲁维酵母属；念珠菌属；汉逊酵母属；德巴利酵母属；毛霉属；毕赤酵母属；球拟酵母属；曲霉属；节丛孢属；短杆菌；微杆菌属；节杆菌属；柠檬酸杆菌属；克雷伯氏菌属；泛菌属；以及梭菌属。
24.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为解脂耶氏酵母。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞用编码细菌视紫红质相关蛋白质样同源物的核酸分子转化，其中所述核酸分子包含与seq id no:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44以及46中的任一者的核苷酸序列至少85％同一的核苷酸序列。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞进一步用编码视黄醛还原酶的核酸分子转化，其中所述核酸分子包含与seq id no:48的核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：路万里，伍奕晟，J·T·柯特尼，S·R·约翰逊，O·余，
申请(专利权)人：康纳根有限公司，
类型：发明
国别省市：
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