改良Cry3的方法、改良Cry3、质粒及其应用技术

本发明专利技术提供了一种增强Ｃｒｙ３（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３）对玉米根虫的杀虫能力的方法，所述方法为：对Ｃｒｙ３的Ｎ端第１～５０位氨基酸序列进行结构改良，所述结构改良为删除和／或插入至少一个多肽片段，所述多肽片段长度为１～５０个氨基酸，所述Ｃｒｙ３为Ｃｒｙ３Ａ或Ｃｒｙ３Ｂ。本发明专利技术的有益效果主要体现在：提供了一种增强Ｃｒｙ３（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３）对玉米根虫的杀虫能力的方法，利用这种方法获得的改良Ｃｒｙ３蛋白的转基因抗虫玉米，对玉米根虫有较好的杀虫能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫 (D/a6raf/ca v/rp/era v/rg(/^a )的杀虫能力的方法，以及利用这种方法获 得的改良Cry3、所用质粒，及其在制备转基因抗虫玉米中的应用。(二)
技术介绍
玉米根虫是一种最具有破坏性的玉米害虫。在美国，3种重要种分别为 西方玉米才艮虫(￡). v/rpy^ra v/rgi/^a )、北方玉米才艮虫(D. wwfec/7w/ wwctoto / cwar<i/)和南方玉米才艮虫(D. wm/ec/wpwwctoto /7cmwc//)。 西方玉米才艮 虫和北方玉米根虫是美国玉米栽培中的首要害虫。玉米根虫通过取食植物 根部引起植物严重损伤。这种损伤表现在增加玉米倒伏，减少玉米产量和 生物量而改变植物的营养含量。玉米根虫的取食还间接影响植物病原生物 的侵入，幼虫对根的损伤，使植物病原细菌、真菌等微生物可以更容易侵 入到植物中。玉米根虫成虫在夏末玉米田中非常活跃，它们取食叶耳，叶丝和花粉，干扰了玉米的正常授粉。苏云金芽孢杆菌(5ac/〃ws AwW"g/e"^)最早于1902年在日本国发现， 1911年在德国再次被发现并得鉴定，是一种格兰氏阳性细菌。在它的孢子 形成过程中，合成出大量的杀虫结晶包涵体(insecticidal crystalline inclusions),其中的晶体蛋白质(crystalline protein, Cry)是由叫啦文cr-内毒 素(a -endotoxins)的原毒素亚基(protoxin subunit)组成的。大多数的苏云金芽孢杆菌菌抹都会产生一系列的CT-内毒素，它对许多昆虫都具有特异的毒性，古文这种蛋白质又叫啦夂杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein ， ICP),或苏云会芽孢杆菌毒蛋白(Bttoxin)。此外，苏云金芽孢杆菌在生长及芽孢 形成期间，还能分泌一些外毒素，叫做苏云金毒素或P-外毒素((3 -exotoxin),同样也具有抑制幼虫生长的能力苏云金芽孢杆菌CSac/〃ws f/mn>7g/e"w、，价)5-内毒素Cry3有杀曱虫 的活性。Cry3A蛋白对科罗拉多马铃薯曱虫(afecemZ/weato ) 有很好的杀虫活性，但对D/Wraaca属的曱虫没有杀虫活性(Johnson et al., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330 333)。根据Slaney等所述(1992， Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9 18), Cry3A蛋白对科罗拉多马铃薯曱虫的杀虫 活性是南方玉米才艮虫(D.腦(iec/w/ wwctoto /zcwani/ )的200(M咅。而且，Cry3A 蛋白对西方玉米根虫有很小的或者没有杀虫活性。同样，Cry3B对西方玉 米根虫有比较低的杀虫能力，但是杀虫活性仍然不够理想。由于S-内毒素杀虫机理的了解，改造S-内毒素使其更有杀虫活性成为 了可能。Li等人1991年确定Cry3A的三维结构时，改造S-内毒素更成就为 一种可能。Cry3A蛋白具有3个结构域N-端的l-290个氨基酸是第一个结 构域，由7个a螺旋组成；第二个结构域从291-500个氨基酸，包含3个卩折 叠；C-端的501-644个氨基酸是第三个结构域，是一个(3-折叠。基于这种 结构，提出了一个关于S-内毒素结构和功能关系的一个假说。这个假说一 般来说是结构域I是在昆虫肠膜形成穿孔的主要因素(Gazit and Shai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816 2820),结构域II是和肠膜受体结合的主 要部分(Gazit and Shai， 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816 2820),而结 构域III有调节离子通道活性的功能(Chen et al., 1993, PNAS 90:9041 9045),最有可能和蛋白的稳定性有关(Li et al. 1991, supra)。Van Rie等人1997年通过随机替换一个Cry3A蛋白质中在溶解性方 面有重要作用的氨基酸(接近结构域II的丙胺酸)来改造Oj3A这几个随机替换中有几个限制了结构域II对受体的结合，增加了西方玉米根虫的活性。然而，其他研究显示在Cry3」结构域n中有的丙胺酸的替换破坏了 受体结合能力，引起结构的不稳定(Wu and Dean， 1996， J. Mol. Biol. 255: 628 640)。 English等人1999年报道Cry3Bb中的氨基酸替代引起了其对南方 玉米才艮虫和西方的杀虫活性的增加(Intl. Pat. Appl. Publ. No. WO 99/31248)。然而，在35个Cry3Bb的突变中，只有3个主要在结构域II以及 结构域II和I的交界处的突变可以对西方玉米根虫有杀虫活性。而且，在对 西方玉米根虫相同生物测定中野生型的Cry3Bb毒性的区别远大于突变 Cry3Bb和野生型Cry3Bb的区别。因此，Cry3Bb突变体毒性的提高仅限于 南方玉米才艮虫。Cry3A的另外一种改良是在Cry3A的氨基酸107 117插入一个 Cathpsin-G的位点而增加了对西方玉米根虫的杀虫能力(美国专利US Pat. 7030295; US Pat. 7230167)。改造的Cry3A毒素可以形成一个蛋白 酶G的识别位点，据说改造后位于107-115个氨基酸之间的蛋白酶 Cathpsin-G的识别位点可以改变0_yW毒素的杀虫能力。这样改造过的 Cry3A对西方玉米才艮虫(D. Wrgz/era v,>gz/era )的杀虫能力比原Cry3A更 高。但是目前还没有一种对西方玉米根虫(D. v//^/era vz>g^ra )有理想 杀虫活性的S-内毒素(包括Cry3A, Cry3B， Cry3C, Cry7A, Cry8A, Cry8B, and Cry8C)可以用来发展优秀的转基因玉米来控制玉米根虫对作物的危害。
技术实现思路
本专利技术针对控制玉米根虫的需要,提供了 一种增强苏云金芽孢杆菌杀 虫蛋白质Cry3对玉米根虫的杀虫能力的方法，以及利用这种方法获得的改良Cry3、所用质粒，及其在制备转基因抗虫玉米中的应用。 本专利技术采用的技术方案是一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫的杀虫能力的 方法，所述方法为对Cry3的N端第1 40位氨基S臾序列进行改变，所 述结构改变为删除和/或插入至少 一个多肽片段，所述多肽片段长度为 1 40个氨基酸，所述Cry3为Cry3A或Cry3B。经过改变的Cry3可以通 过昆虫生物测定来确定和选择增强了对玉米根虫的杀虫能力的改良 Cry3。 Cry3是一种苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白质，其在Bt中有二种不 同的分子形式。 一种是比较长的分子；另一种是同样有活性的比较短的分 子，例如本专利技术涉及的599个氨基酸残基的Cry3A ( SEQ ID No: 1 )。本 专利技术要点在于通过将Cry3的N端第1 40位氨基酸序列改变，从而增强 了其对玉米根虫的杀虫活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Ｃｒｙ３对玉米根虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｖｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）的杀虫能力的方法，所述方法为：对Ｃｒｙ３的Ｎ端第１～４０位氨基酸序列进行删除和／或插入至少一个多肽片段，所述多肽片段长度为１～４０个氨基酸，所述Ｃｒｙ３为Ｃｒｙ３Ａ或Ｃｒｙ３Ｂ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈志成，方军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]