【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种抗pd-l1纳米抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1，pd-l1)也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，cd274)或b7同源体(b7 homolog 1，b7-h1)，是人类体内的一种蛋白质，由cd274基因编码，分子量为40kd的第一型跨膜蛋白，属于b7家族。
2、研究发现，pd-l1蛋白主要表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell,apc)、活化的t细胞、b细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层细胞、心脏内皮细胞和胸腺皮质上皮细胞。在多种人类肿瘤组织中可检测到pd-l1的表达，并且较正常组织pd-l1表达水平高。t细胞表面受体pd-1与其配体pd-l1结合后，招募蛋白酪氨酸磷酸酶1(src homology region 2domain-containing phosphatase-1,shp-1)和shp-2，生成一个阻滞信号抑制下游效应pi3k/akt通路的磷酸化以及mtor和erk2的活化，促进cd4+foxp3-t细胞向cd4+foxp3+tregs分化。简言之，肿瘤微环境中的肿瘤细胞表面pd-l1表达增高，与活化的t细胞表面的pd-1结合，会传递负性调控信号，导致肿瘤抗原特异性t细胞的凋亡或免疫无能，从而抑制免疫反应。目前发现使用抗体阻断pd-1/pd-l1信号通路，能够恢复t细胞对肿瘤细胞的杀伤力，帮助癌症患者用自身
3、纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区。单独克隆并表达出来的vhh结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。vhh晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kd，因此也被称作纳米抗体(nanobody，nb)。纳米抗体具有分子量小，易于渗透进致密组织甚至是血脑屏障；亲和力高、特异性强、溶解性及稳定性好；人体的免疫原性弱，生物相容性好；原核或真核系统中高表达，易于生产；nb结构简单，易于工程化改造等优势。
4、综上所述，开发新型针对pd-l1的纳米抗体，对于肿瘤治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种抗pd-l1纳米抗体及其制备方法和应用，本专利技术筛选并制备具备高亲和力的抗pd-l1纳米抗体，在免疫检测、肿瘤治疗等领域具有广阔的应用前景。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种抗pd-l1纳米抗体，所述抗pd-l1纳米抗体的vhh链的互补决定区选自下组中任意一种：
4、(1)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的cdr1、cdr2和cdr3；
5、(2)氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的cdr1、cdr2和cdr3；
6、(3)氨基酸序列分别如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9所示的cdr1、cdr2和cdr3；
7、(4)氨基酸序列分别如seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12所示的cdr1、cdr2和cdr3。
8、本专利技术中，筛选抗pd-l1纳米抗体，所述抗pd-l1纳米抗体仅包括重链可变区具备高亲和力和特异性，能够高效靶向pd-l1，结构简单，易于制备，在免疫检测、肿瘤治疗等领域具有广阔的应用前景。
9、seq id no:1：gftvsnsavs。
10、seq id no:2：lidsnrntv。
11、seq id no:3：kgiwgstl。
12、seq id no:4：gsifritpva。
13、seq id no:5：vitdngstd。
14、seq id no:6：srarpvrwt。
15、seq id no:7：gftfstsfvs。
16、seq id no:8：rispggasts。
17、seq id no:9：reiysgrfsgfdy。
18、seq id no:10：giisdinmva。
19、seq id no:11：kifrggsty。
20、seq id no:12：ariqiradrdysdy。
21、可以理解，又一方面，本专利技术要求保护纳米抗体的重链可变区vhh，所述vhh互补决定区选自下组中任意一种：
22、(1)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的cdr1、cdr2和cdr3；
23、(2)氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的cdr1、cdr2和cdr3；
24、(3)氨基酸序列分别如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9所示的cdr1、cdr2和cdr3；
25、(4)氨基酸序列分别如seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12所示的cdr1、cdr2和cdr3。
26、可以理解，在上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列基础上任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与pd-l1结合能力的衍生序列，均在本专利技术保护范围内。
27、本专利技术一具体实施例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留与pd-l1特异性结合能力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
28、优选地，所述抗pd-l1纳米抗体的vhh链的氨基酸序列选自seq id no:13-seq idno:16所示序列或与其同源性至少为80％的序列中任意一种，包括但不限于至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
29、seq id no:13：
30、qvqlqesggglvqpg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体的VHH链的互补决定区选自下组中任意一种：
2.根据权利要求1所述抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16所示序列或与其同源性至少为80％的序列中任意一种。
3.一种PD-L1结合分子，所述PD-L1结合分子含有权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体或所述重链可变区VHH。
4.一种人源化抗体或其活性片段，所述人源化抗体由权利要求1或2所述的纳米抗体得到。
5.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR含有一胞外结构域，所述胞外结构域包含如权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体、或如权利要求4所述的人源化抗体。
6.一种融合蛋白，所述融合蛋白具有：
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体、权利要求3所述PD-L1结合分子、权利要求4所述的人源化抗体或其活性片段、权利要求5所述的嵌合抗原受体或权利要求7所述
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求7所述的核酸分子。
9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的重组表达载体。
10.一种制备权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：
11.权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体在靶向结合PD-L1中的应用。
12.权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体、权利要求3所述PD-L1结合分子、权利要求4所述的人源化抗体或其活性片段、权利要求5所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的重组表达载体或权利要求9所述的重组细胞在制备靶向治疗肿瘤的药物中的应用；
13.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体、权利要求3所述PD-L1结合分子、权利要求4所述的人源化抗体或其活性片段、权利要求5所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的融合蛋白和偶联部分；
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体、权利要求3所述PD-L1结合分子、权利要求4所述的人源化抗体或其活性片段、权利要求5所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的重组表达载体、权利要求9所述的重组细胞或权利要求10所述的免疫偶联物中任意一种或至少两种的组合。
15.一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞含有权利要求8所述的重组表达载体或其基因组中整合有外源的如权利要求7所述的核酸分子，或表达如权利要求5所述的嵌合抗原受体。
16.一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
...【技术特征摘要】
1.一种抗pd-l1纳米抗体，其特征在于，所述抗pd-l1纳米抗体的vhh链的互补决定区选自下组中任意一种：
2.根据权利要求1所述抗pd-l1纳米抗体，其特征在于，所述抗pd-l1纳米抗体的vhh链的氨基酸序列选自seq id no:13-seq id no:16所示序列或与其同源性至少为80％的序列中任意一种。
3.一种pd-l1结合分子，所述pd-l1结合分子含有权利要求1或2所述的抗pd-l1纳米抗体或所述重链可变区vhh。
4.一种人源化抗体或其活性片段，所述人源化抗体由权利要求1或2所述的纳米抗体得到。
5.一种嵌合抗原受体(car)，所述car含有一胞外结构域，所述胞外结构域包含如权利要求1或2所述的抗pd-l1纳米抗体、或如权利要求4所述的人源化抗体。
6.一种融合蛋白，所述融合蛋白具有：
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1或2所述的抗pd-l1纳米抗体、权利要求3所述pd-l1结合分子、权利要求4所述的人源化抗体或其活性片段、权利要求5所述的嵌合抗原受体或权利要求7所述的融合蛋白的编码核酸。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求7所述的核酸分子。
9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的重组表达载体。
10.一种制备权利要求1或2所述的抗pd-l1纳米...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐银凤，郑彬彬，王璐，李蕾，李婷婷，唐甜，蒋立仲，李宗艳，王建刚，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：
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