【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体为一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法。
技术介绍
1、恶性肿瘤(癌症)是一种由体内正常细胞基因突变引发的疾病，这些突变导致细胞失去生长和分化的正常调控，从而无限制地增殖和分化。恶性肿瘤细胞不仅能侵犯周围组织和器官，还能通过血液和淋巴系统转移到身体其他部位形成转移灶。肺癌是其中一种严重的恶性肿瘤，其发病率和死亡率都很高，尤其是中晚期肺癌，治疗难度较大。
2、传统的肺癌治疗方法包括手术切除、放疗、化疗等，但对于中晚期肺癌患者来说，由于肿瘤的广泛扩散和侵袭性，这些治疗手段往往效果有限。近年来，靶向治疗和免疫疗法的发展为肺癌治疗提供了新的策略。特别是免疫疗法，通过激活和增强患者自身的免疫系统来攻击肿瘤细胞，已经显示出在肺癌治疗中具有潜力。
3、肿瘤浸润性淋巴细胞(tils)是肿瘤微环境中的关键免疫细胞，它们能够渗透进入肿瘤组织并对抗肿瘤细胞。tils主要包括t细胞亚群，它们通过识别肿瘤细胞表面的抗原和释放细胞因子来发挥抗肿瘤作用。然而，tils在肿瘤微环境中常常受到免疫抑制因子的影响，导致其活性和功能受限。
4、因此，本专利技术提出一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，来解决现有技术的不足。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，即利用纳秒级脉冲电场(nspef)技术对tils进行预处理，以增强其抗肿
2、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、提供一纳秒级脉冲电场装置，该装置能够产生具有特定电压和频率的脉冲电场，其中电压范围设定为10至500伏特，脉冲宽度设定为10至300纳秒，频率设定为1至500赫兹；
4、s2、从确诊为中晚期肺癌的患者体内提取tils，通过细针抽吸法结合酶消化法，从患者的肿瘤组织中提取tils，并采用密度梯度离心法对tils进行纯化处理；
5、s3、使用s1步骤中提供的纳秒级脉冲电场装置对s2步骤中提取并纯化的tils进行预处理，其中预处理参数包括但不限于设定电场强度为30至300伏特/毫米，脉冲宽度为50至200纳秒，频率为10至1000赫兹，每次处理时长为1至10秒，间隔时间为1至5分钟，共进行3至10次处理。
6、优选的，一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，进一步包括基础研究和临床研究两个阶段，其中基础研究阶段使用动物模型来验证tils预处理参数的有效性和安全性，临床研究阶段在获得伦理委员会批准后，在中晚期肺癌患者中进行tils的预处理和治疗效果评估。
7、优选的，所述基础研究步骤包括：
8、(a)、制备中晚期肺癌动物模型，选择适宜品种的实验用小鼠，c57bl/6或balb/c小鼠，并通过皮下接种人肺癌细胞株，a549或h1975，制备实验性肺癌；
9、(b)、从动物模型中提取tils，通过手术切除肿瘤组织并应用胶原酶iv和dna酶i的混合液进行消化处理，随后采用ficoll-paqueplus介质进行密度梯度离心，获得tils，并通过免疫荧光标记和流式细胞术进行细胞表型和功能鉴定；
10、(c)、对tils进行纳秒级脉冲电场预处理，使用具有精确控制功能的脉冲电场发生器，设定特定参数组合进行预处理，电压设置为200伏特/毫米，脉冲宽度为100纳秒，频率为50赫兹，每次处理时长为5秒，间隔时间为2分钟，总共进行5次处理；
11、(d)、将预处理后的tils按照不同的脉冲电场参数分为至少三组，每组在相同的电场参数下进行预处理，然后将tils回输至相应的动物模型中，通过肿瘤生长延迟、动物存活时间和免疫细胞浸润程度指标评估预处理tils的抗肿瘤效果。
12、优选的，所述步骤(a)中动物模型制备，包括在无菌条件下，通过皮下接种肺癌细胞株，1×106至5×106个细胞/每只小鼠，建立实验性肺癌模型，并在肿瘤形成后定期监测肿瘤大小，以确保肿瘤的稳定生长和适宜的实验时间点。
13、优选的，所述步骤(b)中的tils提取，培养及鉴定，包括将切除的肿瘤组织在无菌条件下置于含有胶原酶iv和dna酶i的消化缓冲液中，于37℃下轻轻摇晃消化2至4小时，随后通过100μm细胞过滤器过滤，以去除未消化的组织碎片，然后采用ficoll-paqueplus介质进行密度梯度离心，分离出tils，并使用cd3、cd4、cd8抗体进行免疫标记，通过流式细胞术进行tils的定量和功能状态评估。
14、优选的，所述步骤(c)中的脉冲电场预处理tils，详细涉及使用具有可调节输出电压和频率的脉冲电场发生器，其中电场强度可在30至300伏特/毫米之间调节，脉冲宽度可在50至200纳秒之间调节，频率可在10至1000赫兹之间调节，每次处理时长可在1至10秒之间调节，间隔时间可在1至5分钟之间调节，总共进行3至10次处理，以优化tils的细胞膜通透性和电位。
15、优选的，所述步骤(d)中的分组，包括将预处理后的tils根据预处理参数的不同，分成至少三组，每组根据其预处理参数对动物模型进行tils回输治疗，并通过肿瘤体积测量、免疫组化染色和细胞因子分析实验手段评价预处理tils的抗肿瘤效果。
16、优选的，所述临床研究步骤包括：
17、①、从确诊为中晚期肺癌的患者的肿瘤组织中提取tils，通过外科切除或细针抽吸法获取肿瘤组织样本，并采用胶原酶iv和dna酶i的混合液进行消化处理，随后使用ficoll-paqueplus介质进行密度梯度离心法对tils进行纯化处理，并通过免疫荧光标记和流式细胞术进行tils的表型和功能鉴定；
18、②、将提取的tils在含有10％热失活胎牛血清和重组人il-2的rpmi1640培养基中进行培养和扩增，维持在37℃、5％co2的细胞培养箱中，每48小时更换一次培养基，直至细胞数达到临床治疗所需数量；
19、③、对tils进行纳秒级脉冲电场预处理，使用具有精确控制功能的脉冲电场发生器，设定最优化的预处理参数，电压设置为200伏特/毫米，脉冲宽度为100纳秒，频率为50赫兹，每次处理时长为5秒，间隔时间为2分钟，总共进行5次处理，以增强tils的功能；
20、④、将预处理后的tils通过直接注射到患者的肿瘤组织中或静脉注射输送到患者全身，作为中晚期肺癌患者的干预治疗，直接注射时使用导管或特制针头将tils注射到肿瘤内部或周边组织中，静脉注射时将tils缓慢注入患者的中心静脉或外周静脉中，以允许tils通过血液循环分布到全身各处。
【技术保护点】
1.一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，进一步包括基础研究和临床研究两个阶段，其中基础研究阶段使用动物模型来验证TiLs预处理参数的有效性和安全性，临床研究阶段在获得伦理委员会批准后，在中晚期肺癌患者中进行TiLs的预处理和治疗效果评估。
3.根据权利要求2所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述基础研究步骤包括：
4.根据权利要求3所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中动物模型制备，包括在无菌条件下，通过皮下接种肺癌细胞株，1×106至5×106个细胞/每只小鼠，建立实验性肺癌模型，并在肿瘤形成后定期监测肿瘤大小，以确保肿瘤的稳定生长和适宜的实验时间点。
5.根据权利要求3所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中的TiLs提取
6.根据权利要求3所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中的脉冲电场预处理TiLs，详细涉及使用具有可调节输出电压和频率的脉冲电场发生器，其中电场强度可在30至300伏特/毫米之间调节，脉冲宽度可在50至200纳秒之间调节，频率可在10至1000赫兹之间调节，每次处理时长可在1至10秒之间调节，间隔时间可在1至5分钟之间调节，总共进行3至10次处理，以优化TiLs的细胞膜通透性和电位。
7.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中的分组，包括将预处理后的TiLs根据预处理参数的不同，分成至少三组，每组根据其预处理参数对动物模型进行TiLs回输治疗，并通过肿瘤体积测量、免疫组化染色和细胞因子分析实验手段评价预处理TiLs的抗肿瘤效果。
8.根据权利要求2所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述临床研究步骤包括：
9.根据权利要求8所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述步骤①中的TiLs提取及鉴定，详细涉及在无菌手术环境下，使用细针抽吸法或外科手术切除法获取患者的肿瘤组织样本，随后置于含有胶原酶IV和DNA酶I的消化缓冲液中，在37℃下轻轻摇晃消化2至4小时，过滤后使用Ficol l-PaquePLUS介质进行密度梯度离心，分离出TiLs，并使用特定免疫标记进行TiLs的定量和功能状态评估；所述步骤②中的TiLs培养和扩增，详细涉及将提取的TiLs接种到含有10％热失活胎牛血清和重组人IL-2的RPMI 1640培养基中，并在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养，每48小时更换一次培养基，直至细胞数达到临床治疗所需数量，此过程中定期监测细胞生长状态和细胞活性。
10.根据权利要求8所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法，其特征在于，所述步骤③中的脉冲电场调控技术的优化及TiLs干预，详细涉及使用具有可调节输出电压和频率的脉冲电场发生器，对TiLs进行预处理，其中电场强度在30至300伏特/毫米之间调节，脉冲宽度在50至200纳秒之间调节，频率在10至1000赫兹之间调节，每次处理时长可在1至10秒之间调节，间隔时间在1至5分钟之间调节，总共进行3至10次处理，优化后的预处理参数能够显著提高TiLs对中晚期肺癌细胞的识别和杀伤功能，增强患者体内的抗肿瘤免疫反应；所述步骤④中的TiLs移植治疗，详细涉及两种TiLs输送方法：直接注射和静脉注射，其中直接注射方法包括使用经过无菌处理的针头或导管，将TiLs精确注射到肿瘤组织内部或周边组织中，从而使TiLs能够直接与肿瘤细胞接触，其中静脉注射方法包括将TiLs稀释在生理盐水中，并缓慢注入患者的中心静脉或外周静脉，利用患者的血液循环将TiLs输送到全身，以寻找并攻击肿瘤细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，进一步包括基础研究和临床研究两个阶段，其中基础研究阶段使用动物模型来验证tils预处理参数的有效性和安全性，临床研究阶段在获得伦理委员会批准后，在中晚期肺癌患者中进行tils的预处理和治疗效果评估。
3.根据权利要求2所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述基础研究步骤包括：
4.根据权利要求3所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中动物模型制备，包括在无菌条件下，通过皮下接种肺癌细胞株，1×106至5×106个细胞/每只小鼠，建立实验性肺癌模型，并在肿瘤形成后定期监测肿瘤大小，以确保肿瘤的稳定生长和适宜的实验时间点。
5.根据权利要求3所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中的tils提取，培养及鉴定，包括将切除的肿瘤组织在无菌条件下置于含有胶原酶iv和dna酶i的消化缓冲液中，于37℃下轻轻摇晃消化2至4小时，随后通过100μm细胞过滤器过滤，以去除未消化的组织碎片，然后采用ficol l-paqueplus介质进行密度梯度离心，分离出tils，并使用cd3、cd4、cd8抗体进行免疫标记，通过流式细胞术进行tils的定量和功能状态评估。
6.根据权利要求3所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中的脉冲电场预处理tils，详细涉及使用具有可调节输出电压和频率的脉冲电场发生器，其中电场强度可在30至300伏特/毫米之间调节，脉冲宽度可在50至200纳秒之间调节，频率可在10至1000赫兹之间调节，每次处理时长可在1至10秒之间调节，间隔时间可在1至5分钟之间调节，总共进行3至10次处理，以优化tils的细胞膜通透性和电位。
7.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期肺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中的分组，包括将预处...
【专利技术属性】
技术研发人员：晁晓东，蔡敏，王立兵，许艳慧，
申请(专利权)人：初源诺康医疗技术开发西安有限公司，
类型：发明
国别省市：
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