【技术实现步骤摘要】
技术介绍
0、背景
1、纤维素材料为产生化石燃料的可替代能源提供了一个有吸引力的平台。将纤维素材料(例如，来自木质纤维素原料)转化成生物燃料具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的合意性以及生物燃料(如乙醇)的清洁性。木材、农业废弃物、草本作物以及城市固体废物已被认为是用于生物燃料生产的原料。一旦将纤维素材料糖化并转化成可发酵的糖(例如，葡萄糖)，那么这些可发酵的糖就可以被酵母发酵成生物燃料(如乙醇)。
2、在过去十年里已经研发了新的且改进的酶和酶组合物并且已经使得预处理的纤维素材料的糖化变得更有效。然而，仍需要改进预处理的纤维素材料的糖化以及用于生产生物燃料的方法。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、在此描述了将纤维素材料糖化成可发酵的糖的方法。还描述了通过糖化和发酵从纤维素材料(如预处理的纤维素材料)生产发酵产物(如乙醇)的方法。
2、在一个方面中，本专利技术涉及糖化纤维素材料的方法，这些方法包括在浓度处于至少0.5％的饱和度的溶解氧的存在下使该纤维素材料经受过氧化氢酶、纤维素分解酶组合物和gh61多肽。
3、在另一个方面中，本专利技术涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括：
4、(a)在浓度处于至少0.5％的饱和度的溶解氧的存在下使纤维素材料经受过氧化氢酶、纤维素分解酶组合物和gh61多肽；
5、(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料；并且
6、(c)任
7、在一个实施例中，纤维素材料已经例如通过化学和/或物理预处理(如稀酸和/或蒸汽爆炸预处理)而被预处理。在一个实施例中，纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwpcs)。
8、使用本专利技术的方法将预处理的纤维素材料糖化/水解成糖。可以将这些糖转化为许多有用的所希望的物质，例如燃料、可饮用乙醇和/或发酵产物(例如，酸、醇、酮、气体等)。
9、糖化的预处理的纤维素材料可以是以下糖，这些糖可以用在用于生产糖浆(例如，高果糖玉米糖浆(hfcs))和/或塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯)、聚乳酸(例如，用于生产pet)的工艺中。
10、定义
11、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-l-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(ec 3.2.1.55)，其催化α-l-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-l-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-l-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)-和/或(1,5)-键的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、l-阿拉伯糖苷酶、或α-l-阿拉伯聚糖酶。出于本专利技术的目的，使用每ml的100mm乙酸钠(ph 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(megazyme international ireland,ltd.)，布瑞公司(bray,co.)，威克洛郡，爱尔兰)以总体积200微升在40℃下持续30分钟，随后通过hpx-87h柱色谱(伯乐实验室有限公司(bio-rad laboratories,inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行阿拉伯糖分析来确定α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
12、α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指一种α-d-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(ec 3.2.1.139)，其催化α-d-葡糖苷酸水解成d-葡糖醛酸酯和醇。出于本专利技术的目的，根据德弗里斯(de vries)，1998，细菌学杂志(j.bacteriol.)180:243-249来确定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于在ph 5、40℃下每分钟能够释放1微摩尔葡糖醛酸或4-o-甲基葡糖醛酸的酶量。
13、β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-d-葡糖苷葡糖水解酶(e.c.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-d-葡萄糖残基的水解，并释放β-d-葡萄糖。出于本专利技术的目的，根据文丘里(venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-d-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(extracellular beta-d-glucosidase fromchaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties)，基础微生物学杂志(j.basic microbiol.)42:55-66描述的基本程序来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、ph 4.8下，在包含0.01％20的50mm柠檬酸钠中从作为底物的1mm对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
14、β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指一种β-d-木糖苷木糖水解酶(e.c.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的d-木糖残基。可以在包含0.01％20的100mm柠檬酸钠中，在ph 5、40℃下，使用1mm对硝基苯基-β-d-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。出于本专利技术的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、ph 5下，在包含0.01％20的100mm柠檬酸钠中从作为底物的1mm对硝基苯基-β-d-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
15、生物质材料：术语“生物质材料”是指任何含糖生物质(例如，植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树叶、树枝和树木)及其任何组分(如纤维素、半纤维素或木脂素)。应理解的是，除非另外说明，否则生物质材料包括未处理的、预处理的和水解的或部分水解的形式(例如，生物质降解产物，如寡糖)。
16、过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指一种过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(e.c.1.11.1.6或e.c.1.11.1.21)，其催化将两个过氧化氢转化为氧和两个水。可以基于以下反应通过在240nm下监测过氧化氢的降解而确定过氧化氢酶活性：
17、2h2o2→2h2o+o2
18、在25℃下，在具有10.3mm底物(h2o2)和大约100个单位的酶/ml的50mm磷酸盐(ph7)中进行该反应。用分光光度计监测16-24秒内的吸光度，这应该对应于从0.45至0.4的吸光度降低。可以将一个过氧化氢酶活性单位表示为在ph 7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的h2o2。
19、cdna：术语“cdna”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。早先的初始r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在2-30％的饱和度。
2.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在至少0.5ppm，例如像0.5至5ppm、0.5至4.5ppm、0.5至4ppm、0.5至3.5ppm、0.5至3ppm、0.5至2.5ppm、或0.5至2ppm。
3.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、GH61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.025ppm至0.55ppm范围内，例如像0.05至0.165ppm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。
5.如权利
6.如权利要求1、3、4和5中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％、例如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。
7.如权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。
8.如权利要求1、2、4和7中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：草本材料(包括能源作物)、农业废弃物、木材(包括林业废弃物)、城市固体废物、废纸、纸浆以及造纸厂废弃物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、玉米芯、柳枝稷、玉米纤维、稻秸、芒草、芦竹、竹子、橘皮、杨树、松树、白杨、冷杉、云杉、柳树以及桉树。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该纤维素材料例如通过化学和/或物理预处理如稀酸和/或蒸汽爆炸预处理而被预处理。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是预处理的玉米秸秆(PCS)，如稀酸预处理的玉米秸秆。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwPCS)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中糖化进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，例如持续至少12小时，例如，至少24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在糖化24-48小时后开始向该容器中添加氧并继续直到糖化结束。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在整个糖化过程中进行氧的添加。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在约3.0至约9.0范围内的pH下进行糖化，例如，3.5至...
【技术特征摘要】
1.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、gh61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在2-30％的饱和度。
2.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、gh61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在至少0.5ppm，例如像0.5至5ppm、0.5至4.5ppm、0.5至4ppm、0.5至3.5ppm、0.5至3ppm、0.5至2.5ppm、或0.5至2ppm。
3.一种糖化纤维素材料的方法，该方法包括使该纤维素材料在容器中经受纤维素分解酶组合物、gh61多肽和过氧化氢酶，其中向该容器中添加氧，以将溶解氧浓度维持在0.025ppm至0.55ppm范围内，例如像0.05至0.165ppm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中过氧化氢酶的量处于0.5％至25％，例如，0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至7.5％、0.5％至5％以及0.5％至4％的总蛋白范围内。
5.如权利要求1、3和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。
6.如权利要求1、3、4和5中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％、例如至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在0.5％-10％饱和度范围内，例如0.5％-7％、例如0.5％-5％、例如0.5％-4％、例如0.5％-3％、例如0.5％-2％、例如1％-5％、例如1％-4％、例如1％-3％、例如1％-2％。
7.如权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中糖化过程中的溶解氧浓度处于大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。
8.如权利要求1、2、4和7中任一项所述的方法，其中在糖化期的至少25％，例如至少50％或至少75％过程中，将溶解氧浓度维持在大于10％上至90％饱和度范围内，例如大于10％上至80％、大于10％上至70％、大于10％上至60％、大于10％上至50％、大于10％上至40％、大于10％上至30％、以及大于10％上至20％。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：草本材料(包括能源作物)、农业废弃物、木材(包括林业废弃物)、城市固体废物、废纸、纸浆以及造纸厂废弃物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该纤维素材料选自下组，该组由以下各项组成：玉米秸秆、麦秸、甘蔗渣、玉米芯、柳枝稷、玉米纤维、稻秸、芒草、芦竹、竹子、橘皮、杨树、松树、白杨、冷杉、云杉、柳树以及桉树。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该纤维素材料例如通过化学和/或物理预处理如稀酸和/或蒸汽爆炸预处理而被预处理。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是预处理的玉米秸秆(pcs)，如稀酸预处理的玉米秸秆。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的，如未洗涤的预处理的玉米秸杆(uwpcs)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中糖化进行长达200小时，例如，约12至约96小时、约16至约72小时或约24至约48小时，例如持续至少12小时，例如，至少24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在糖化24-48小时后开始向该容器中添加氧并继续直到糖化结束。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在整个糖化过程中进行氧的添加。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在约25℃至约75℃范围内的温度下进行糖化，例如，约30℃至约70℃、约35℃至约65℃、约40℃至60℃、约45℃至55℃或约50℃。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在约3.0至约9.0范围内的ph下进行糖化，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。
20.如权利要求19所述的方法，进一步包括在糖化过程中添加碱，以将ph维持在约3.0至约9.0范围内，例如，3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5或约5.0。
21.如权利要求20所述的方法，其中该碱选自下组，该组由以下各项组成：koh、naoh、ca(oh)2以及nh4oh。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中以25-2,500mmol碱/kg干纤维素材料的量添加该碱，例如25-1000mmol/kg、25-500mmol/kg、25-250mmol/kg、50-200mmol/kg。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中糖化过程中的干固体含量(例如，该纤维素材料中的总固体)低于约30wt.％、25wt.％、20wt.％、15wt.％、10wt.％、7.5wt.％、5wt.％、2.5wt.％、2wt.％、1wt.％或0.5wt.％，例如在5wt.％与30wt.％之间或在10wt.％与25wt.％之间。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物具有真核生物来源，如真菌来源，例如，丝状真菌来源。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物来源于木霉属(例如，里氏木霉)。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物至少包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶i、纤维二糖水解酶ii、内切葡聚糖酶以及β-葡糖苷酶。
28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。
29.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶i、纤维二糖水解酶ii、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。
30.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶i、纤维二糖水解酶ii、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶以及β-木糖苷酶。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括选自下组的一种或多种蛋白质，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、cip、香豆酸酯酶、酯酶、棒曲霉素、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、漆酶、木质素分解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶、以及膨胀蛋白。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中该gh61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在wo 2005/074656中描述为seq id no:2或在此的seq idno:1的gh61多肽；或来源于梭孢壳霉属，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如在wo 2005/074647中描述为seq id no:7和seq id no:8或在此的seq id no:4的gh61多肽；或来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在wo 2010/138754中描述为seq id no:1和seq id no:2或在此的seq id no:3的gh61多肽；或青霉属的菌株，例如埃默森青霉的菌株，例如披露于wo 2011/041397或在此的seq id no:2中的gh61多肽。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包括β-葡糖苷酶，优选来源于以下项的β-葡糖苷酶：曲霉属的菌株，例如米曲霉，例如披露于wo02/095014中的β-葡糖苷酶或披露于wo 2008/057637中的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·徐，J·弗里克曼，J·刘，K·S·约翰森，H·Z·黄，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：
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