【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及时间分辨免疫层析快速检测，特别是涉及一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡及其制备方法与应用。
技术介绍
1、近年来，随着人们环保意识和健康生活理念的兴起，越来越多的研究集中到农药残留、粮食检测上来。在植物的生长过程中，会面对各种各样的病虫、真菌、细菌等危害，为解决这一问题，出现了种类多样的农药试剂，然而，农药使用给农业带来巨大价值的同时，也给环境和人身健康带来了威胁。
2、多菌灵是一种具有高效、低毒、内吸性特点的系统性苯并咪唑类杀菌剂，被广泛用于控制农作物、水果、观赏植物和药材上的多种真菌病害，其作用于病原菌的有丝分裂，干扰纺锤体的形成，进而抑制细胞分裂，起到杀菌作用，被广泛应用于真菌（担子菌、半知菌、多子囊菌）引起的病害，如根菌腐病、褐斑病、叶枯病等。由于植物对于农药抗药性的产生，多菌灵经常被高频率、高剂量地施用到农作物上，这可能会导致环境中的残留污染。此外，一些研究报告指出，多菌灵在不同类型土壤中的降解半衰期可长达约 12 个月，表明其化学结构稳定性和持久性良好，大量施用多菌灵可能会导致残留物在环境和食物链中积累，因此，建立高效、准确的分析方法具有十分重要的意义。
3、目前，对于多菌灵的检测方法，主要有液相色谱法，液相色谱-质谱联用法，分光光度计法及毛细管电泳法等。其中，色谱法准确度好，精度高，但需要专业人员操作，耗时长，仪器昂贵；紫外分光光度法在多菌灵农药残留检测方面应用最为广泛，但由于其计算方法复杂，误差大、样品前处理复杂等缺点，在多菌灵农药残留检测方面的应用受
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡，用于解决现有技术中对于多菌灵的检测方法难以兼顾准确性和操作简单的问题，同时，本专利技术还将提供一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡的制备方法；此外，本专利技术还将提供一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的方法。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡，其由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（nc膜）、吸水纸依次搭接粘贴在pvc底板上组成，所述硝酸纤维素膜在结合垫向吸水纸方向依次设有质控线（c）、检测线（t），所述质控线包被有山羊抗鸡igy多克隆抗体，所述检测线包被有多菌灵半抗原-bsa偶联物；所述结合垫上喷涂有多菌灵抗体-荧光微球标记物和鸡igy抗体-荧光微球标记物的混合物。
4、优选的，所述山羊抗鸡igy多克隆抗体的浓度为0.2~0.3 mg/ml，
5、更为优选的，所述山羊抗鸡igy多克隆抗体的浓度为0.25 mg/ml。
6、优选的，所述多菌灵半抗原-bsa偶联物的浓度为0.25~0.35 mg/ml，
7、更为优选的，所述多菌灵半抗原-bsa偶联物的浓度为0.3 mg/ml。
8、优选的，所述多菌灵抗体-荧光微球标记物的浓度为30~40 μg/ml，
9、更为优选的，所述多菌灵抗体-荧光微球标记物的浓度为35 μg/ml。
10、优选的，所述鸡igy抗体-荧光微球标记物的浓度为25~35 μg/ml，
11、更为优选的，所述鸡igy抗体-荧光微球标记物的浓度为30 μg/ml。
12、进一步的，所述竞争型荧光免疫层析检测卡还包括外壳，所述外壳在位于样品垫的上方开设有上样孔。
13、本专利技术的第二方面，提供一种制备上述快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡的方法，包括以下步骤：
14、s1、分别制备多菌灵抗体-荧光微球标记物和鸡igy抗体-荧光微球标记物的乳胶，加入喷膜稀释液进行稀释并混合，使用喷膜仪均匀喷涂在结合垫表面，烘干备用；
15、s2、分别配制包含多菌灵半抗原-bsa偶联物及山羊抗鸡igy多克隆抗体的划膜液，并在硝酸纤维素膜的相应位置划线，烘干备用；
16、s3、在pvc底板上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，然后剪切成所需的宽度，即得到所述的快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡。
17、在步骤s1中，多菌灵抗体-荧光微球标记物与喷膜稀释液的稀释比例为1：5~10；鸡igy抗体-荧光微球标记物与喷膜稀释液的稀释比例为1：150~200。
18、在步骤s1中，所述多菌灵抗体-荧光微球标记物/鸡igy抗体-荧光微球标记物的制备方法，包括以下步骤：
19、a、通过1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（edc）活化空白微球；
20、b、加入多菌灵抗体/鸡igy抗体与微球进行偶联；
21、c、加入封闭液封闭微球表面的空余位点，得到所述的多菌灵抗体-荧光微球标记物/鸡igy抗体-荧光微球标记物。
22、步骤a的具体操作步骤为：使用标记缓冲液稀释空白微球，稀释比例为1：8~10（微球：标记缓冲液），超声混匀2~5 min，向混匀的微球中加入10 mg/ml的edc水溶液进行活化，振荡混匀后，置于35 ℃摇床中活化30 min，离心后弃上清，等体积加入标记缓冲液复溶。
23、步骤b的具体操作步骤为：向步骤a得到的溶液中加入多菌灵抗体/鸡igy抗体，振荡混匀，置于4 ℃摇床中，偶联2 h，反应结束后超声混匀，离心弃除上清。
24、步骤c的具体操作步骤为：向步骤b得到的溶液中加入等体积的封闭液复溶，置于35 ℃摇床中，恒温封闭1 h，结束后，超声混匀，离心弃除上清，等体积加入喷膜稀释液复溶。
25、优选的，所述标记缓冲液为硼酸缓冲液，其浓度优选为10 mm。
26、优选的，所述封闭液为添加0.1%-1%bsa的硼酸溶液。
27、更为优选的，所述封闭液中还添加有0.01~0.1%的tween-20。
28、优选的，所述喷膜稀释液为10 mm的硼酸溶液，其中添加有10%蔗糖、1%bsa以及0.1%tween-20。
29、优选的，edc水溶液（10 mg/ml）的添加量为5~10 μl，最优选为6 μl。相较于edc水溶液与nhs共同作为活化剂，或不活化处理，选用edc水溶液作为活化剂对羧基微球的活化效果更好。活化剂的用量决定了微球表面羧基的活化程度，选用6 μl的edc水溶液的活化效果最佳。
30、本专利技术将抗体标记于荧光微球表面，通过检测微球的荧光值来放大抗原、抗体的结合效果，建立了直接，迅速、高灵敏、定量检测烟草样本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡，其特征在于，其由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接粘贴在PVC底板上组成，所述硝酸纤维素膜在结合垫向吸水纸方向依次设有质控线、检测线，所述质控线包被有山羊抗鸡IgY多克隆抗体，所述检测线包被有多菌灵半抗原-BSA偶联物；所述结合垫上喷涂有多菌灵抗体-荧光微球标记物和鸡IgY抗体-荧光微球标记物的混合物。
2.根据权利要求1所述的竞争型荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述山羊抗鸡IgY多克隆抗体的浓度为0.2~0.3 mg/mL；所述多菌灵半抗原-BSA偶联物的浓度为0.25~0.35mg/mL。
3.根据权利要求1所述的竞争型荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述多菌灵抗体-荧光微球标记物的浓度为30~40 μg/mL；所述鸡IgY抗体-荧光微球标记物的浓度为25~35 μg/mL。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的竞争型荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，多菌灵抗体-荧光微球
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述多菌灵抗体-荧光微球标记物/鸡IgY抗体-荧光微球标记物的制备方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（10 mg/mL）的添加量为5~10 μL。
8.一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的快速定量检测烟草样本中多菌灵的方法，其特征在于，在步骤1）中，样本的前处理包括以下步骤：将样品粉碎后混匀后得到二次样品，使用80%甲醇+2%氯化钠水溶液作为提取液加入二次样本中，通过超声混匀，离心后得到样本上清液，样本上清液经稀释后，即得待测液。
10.根据权利要求8所述的快速定量检测烟草样本中多菌灵的方法，其特征在于，烟草样本中多菌灵的检出限为50 μg/kg。
...【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测烟草样本中多菌灵的竞争型荧光免疫层析检测卡，其特征在于，其由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接粘贴在pvc底板上组成，所述硝酸纤维素膜在结合垫向吸水纸方向依次设有质控线、检测线，所述质控线包被有山羊抗鸡igy多克隆抗体，所述检测线包被有多菌灵半抗原-bsa偶联物；所述结合垫上喷涂有多菌灵抗体-荧光微球标记物和鸡igy抗体-荧光微球标记物的混合物。
2.根据权利要求1所述的竞争型荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述山羊抗鸡igy多克隆抗体的浓度为0.2~0.3 mg/ml；所述多菌灵半抗原-bsa偶联物的浓度为0.25~0.35mg/ml。
3.根据权利要求1所述的竞争型荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述多菌灵抗体-荧光微球标记物的浓度为30~40 μg/ml；所述鸡igy抗体-荧光微球标记物的浓度为25~35 μg/ml。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的竞争型荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛昭，谈婷，丁丽，孟二翠，肖理文，
申请(专利权)人：南京微测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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