【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及精子线粒体活性检测领域，特别涉及一种哺乳动物精子线粒体活性的检测方法和应用。
技术介绍
1、哺乳动物繁殖力是影响遗传质量的重要因素，是进行遗传改良的重要突破口。目前监测公猪繁殖力最普遍的方式是通过显微镜观测评估精子形态、精子运动力等指标。精子是复杂的细胞，需要满足许多标准才能实现受精，例如，达到过度活化状态、完整的顶体、获能能力、正常的dna结构以及与卵子结合的能力。研究发现仅通过形态学以及运动学指标并不能够准确预测繁殖力，仍然存在指标正常但繁殖力不佳的公畜。因此探究通过多维精液检测方法以在分子水平上准确预测优良种公畜的繁殖力对最大化发挥其种用价值具有实际生产意义。
2、流式细胞术是一种用于对悬浮状态的单细胞在逐个通过传感点时对它们进行测量的系统。流式细胞仪可以在短时间内获取样本中所有亚群的数据，使其成为评估异质种群(如精子)的理想选择。相比于显微观察在计数样本量的局限性上，流式细胞仪有着极大的优势，检测数据也更为精确。同时荧光探针技术的不断发展也为通过流式细胞术丰富精子在分子层间的检测指标提供了可能。
3、线粒体作为精子中十分重要的组成细胞器，通过atp为精子各项生理活动提供能量，并参与从精子发生到受精的多种过程，以调节雄性哺乳动物的生育能力。同时也研究表明线粒体活性影响精子内ros的稳态，这一过程与精子损伤相关。因此对于精子线粒体活性的评估有助于更为准确地预测雄性哺乳动物的繁殖力。
4、现有的针对精子线粒体活性检测的方法，由于需要反复清洗和离心，会在一定程度上对精子造成损伤，
技术实现思路
1、本专利技术的目的是以基于流式细胞术的荧光染料检测法为原理，建立了一种哺乳动物精子线粒体活性的检测方法，该方法简便高效易操作，对精子造成的损伤小，检测准确性高，重复性好，丰富了哺乳动物精子评估指标，有助于为哺乳动物繁殖力的判断提供参考。
2、根据本专利技术的第一个方面，提供了一种哺乳动物精子线粒体活性的检测方法，该方法包括如下步骤：
3、s1、染色工作液配制：按照jc-1染色液：pbs：缓冲液＝1:1165:40的比例配制染色工作液；
4、s2、待测精子与染色工作液孵育：
5、1)将配制好的染色工作液避光加入细胞孔板中；
6、2)将待测精液样品加入步骤s2中的孔板中；
7、3)在恒温箱中37℃避光孵育20min；
8、s3、检测：
9、1)检测设置：用流式细胞仪检测，激发波长为488nm氩离子激光。
10、2)plot1通道设置：以forward scatter对数测量fsc-hlog为横座标，sidescatter对数测量ssc-hlog为纵坐标，绘制散点图，并设置多边形门r1，r1表示选中的精子群体；
11、3)plot2通道设置：以绿色荧光素强度对数检测green-b-hlog为横坐标，红色荧光素强度对数检测red-b-hlog为纵坐标，绘制散点图，并设置多边形门r2，r2表示去除左上角杂质后选中的纯净精子群体；
12、4)plot3通道设置：基于plot2门r2选中的纯净精子群体，再以绿色荧光素强度对数检测green-b-hlog为横坐标，红色荧光素强度对数检测red-b-hlog为纵坐标，绘制散点图，设置四象限门r3，r3中右上象限表示精子染色为红色荧光，为高线粒体活性群体；右下象限表示精子染色为绿色荧光，为低线粒体活性群体。
13、s4、结果分析：根据流式细胞仪测量的精子样本的红色荧光、绿光荧光情况，使用红色荧光染色百分比表示线粒体活性值。
14、在某些实施方式中，所述jc-1染色液是将5,5′，6,6′-四氯-1,1′,3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘溶于dmso制成。
15、在某些实施方式中，在步骤s1中，先将jc-1染色液用pbs稀释，然后再加入相应比例的缓冲液。
16、在某些实施方式中，步骤s2中细胞孔板为96孔板。
17、在某些实施方式中，步骤s2中染色液的添加量为200μl/孔。
18、在某些实施方式中，步骤s3中待测精液样品浓度为2.5×107个/ml，添加量为2μl/孔。
19、在某些实施方式中，所述哺乳动物为猪。
20、根据本专利技术的第二个方面，提供了上述方法在检测哺乳动物精子活性上的应用。
21、根据本专利技术的第三个方面，提供了上述方法在筛选哺乳动物精子活性上的应用。
22、根据本专利技术的第三个方面，提供了上述方法在评价哺乳动物精子活性上的应用。
23、本申请有益效果：
24、(1)可以直接在细胞培养的96孔板进行操作，无需经ep管离心、清洗等繁琐步骤，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，操作简便易上手；
25、(2)检测成本低廉，经优化后，同剂量jc-1染色液能够多检测5倍样品量，提高了试剂利用率，降低了检测成本。
26、(3)检测结果准确和客观并且重复性好，可避免因离心，清洗，处理时间过长带来的精子损失及损伤，结果更为客观和准确。
27、(4)最大程度减少因检测过程或方法而导致的精子损失或损失，最大程度保障精子线粒体活性：同一样品，采用本申请的方法进行检测相较于试剂盒中原方案可大大提高精子线粒体活性。
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1.一种哺乳动物精子线粒体活性的检测方法，其中，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述JC-1染色液是将5,5′，6,6′-四氯-1,1′,3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘溶于DMSO制成。
3.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述步骤S1中，先将JC-1染色液用PBS稀释，然后再加入相应比例的缓冲液。
4.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述步骤S2中细胞孔板为96孔板。
5.根据权利要求3中所述的方法，其中，所述步骤S2中染色液的添加量为200μl/孔。
6.根据权利要求4中所述的方法，其中，所述步骤S3中待测精液样品浓度为2.5×107个/ml，添加量为2μl/孔。
7.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述哺乳动物为猪。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在检测哺乳动物精子活性上的应用。
9.权利要求1-7任一项所述的方法在筛选哺乳动物精子活性上的应用。
10.权利要求1-7任一项所述的方法在评价哺乳动物精子活性上的应用。
【技术特征摘要】
1.一种哺乳动物精子线粒体活性的检测方法，其中，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述jc-1染色液是将5,5′，6,6′-四氯-1,1′,3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘溶于dmso制成。
3.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述步骤s1中，先将jc-1染色液用pbs稀释，然后再加入相应比例的缓冲液。
4.根据权利要求1中所述的方法，其中，所述步骤s2中细胞孔板为96孔板。
5.根据权利要求3中所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦佳丽，赵云翔，朱琳，孙艳梅，
申请(专利权)人：广西扬翔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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