【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程，更具体地说，涉及一种适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法。
技术介绍
1、高质量的参考基因组是作物种质资源挖掘利用和育种改良的基础。而高倍型的复杂基因组组装极具挑战性，面临contig之间连接缺乏充分、准确的读段信息和染色体挂载时contig嵌合错误率高等问题，传统技术下很难完成高质量的复杂多倍体植物基因组组装。pore-c是结合染色质构像捕获(3c)和oxford nanopore technologies(ont)三代长读长测序平台的三维基因组学研究新技术。借助其长读长、捕获多种互作子以及区分等位甲基化等优势可以辅助基因组组装及染色体挂载，增加同源染色体的区分度，解决复杂基因组的染色体分型组装。同时可以解析染色体三维结构，获得全基因组染色体互作图谱。
2、目前已有的pore-c方法都是针对人类或模式植物(如拟南芥)开发，非模式植物特别是复杂基因组植物因富含多糖、多酚等次级代谢物，无法得到高质量和高产出的数据。目前pore-c应用在多倍体模式植物(如异源四倍体陆地棉tm-1)上的产出约为52-61g(promethion平台)，多重互作子平均占比约为43.56％。其较高的数据产出成本和较低比例的互作子是制约其在复杂基因组组装和三维结构研究的根本原因。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于一种适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法，用于构建适用于复杂多倍体植物的pore-c文库。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法：将植物组织研磨成细粉后加入到细胞核提取液中，同时进行dna与蛋白质交联，通过过滤和蔗糖密度梯度离心法得到细胞核沉淀；1×pbs清洗细胞核后用细胞核提取液重悬细胞核，进行percoll密度梯度离心后加入同等体积的0.25m蔗糖分离得到完整纯净的细胞核；然后进行原位细胞核酶切、连接、解交联；后用dna提取液抽提2遍，取上清加入氯化钠、醋酸钠和无水乙醇获取dna。
4、所述植物组织为各种龄期的新鲜或冷冻后的材料。
5、所述细胞核提取液组成为：0.4msucrose、10mm tris-hcl，ph 8、10mm kcl、0.5％triton x-100、10mm edta，ph 8、1％ pvp40、0.25％β-mercaptoethanol、0.1mm pmsf。
6、蔗糖梯度离心溶液组成为：1.7msucrose、20mm tris-hcl，ph 8、2mm kcl、0.2％triton x-100、2mm edta，ph 8、0.25％β-mercaptoethanol、0.1mm pmsf。
7、所述dna提取液组成为：苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1。
8、酶切反应液组成为：30μl 20u/μl hind iii、50μl neb buffer 2.1、20μl无酶水；或，40μl 10u/μl dpn ii、50μl neb buffer 3.1、10μl无酶水。
9、连接反应液组成为：260μl无菌无酶水、100μl 10％ triton x-100、100μl10×ligation buffer、5μl 20μg/μl recombinant albumin、30μl 400u/μl t4 dna ligase；或，415μl无菌无酶水、100μl 10×ligation buffer、5μl 20μg/μl recombinant albumin、30μl 400u/μl t4 dna ligase。
10、所述蔗糖密度梯度离心法为根据基因组大小确定离心力。
11、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
12、1)本专利技术细胞核提取液中加入1％ pvp，将多酚、多糖次级代谢物与dna分开，方便后续过滤去除。
13、2)本专利技术交联采用真空干燥器，进行4次真空/脱气交换，交联充分，获得的高阶互作片段比例增加。
14、3)本专利技术使用蔗糖密度梯度离心法根据基因组大小确定离心力，获得更多的细胞核。
15、4)本专利技术采用50％ percoll密度梯度离心进行细胞核纯化，有效去除次级代谢物，获得完整纯净的细胞核，提高酶切、连接效率。
16、5)本专利技术采用苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1作为dna提取液，抽提两遍dna，有效去除蛋白等杂质，提高数据产出。
17、6)本专利技术的方法提取的dna，无需切胶去除小片段即可提高文库长度，n50最高超过9kb(hind iii内切酶)。
18、7)本专利技术的方法提取的dna得率高，得到5-9μg dna，可以上机3-7个cell，得到300g-1t数据，大大降低了成本。
19、8)本专利技术的方法不局限于幼嫩和新鲜材料，适合各种龄期和冰箱冷冻植物材料。
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1.一种适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于：将植物组织研磨成细粉后加入到细胞核提取液中，同时进行DNA与蛋白质交联，通过过滤和蔗糖密度梯度离心法得到细胞核沉淀；1×PBS清洗细胞核后用细胞核提取液重悬细胞核，进行Percoll密度梯度离心后加入同等体积的0.25M蔗糖分离得到纯净细胞核；然后进行原位细胞核酶切、连接、解交联；后用DNA提取液抽提2遍，取上清加入氯化钠、醋酸钠和无水乙醇获取DNA。
2.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于，所述植物组织为各种龄期的新鲜或冷冻后的材料。
3.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于，所述细胞核提取液组成为：0.4M sucrose、10mM Tris-HCl，pH 8、10mM KCl、0.5％Triton X-100、10mM EDTA，pH 8、1％PVP40、0.25％β-Mercaptoethanol、0.1mM PMSF。
4.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C
5.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于，所述DNA提取液组成为：苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1。
6.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于，酶切反应液组成为：30μL 20U/μL Hind III、50μL NEB buffer 2.1、20μL无酶水；或，40μL 10U/μL Dpn II、50μL NEB buffer 3.1、10μL无酶水。
7.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于，连接反应液组成为：260μL无菌无酶水、100μL 10％Triton X-100、100μL 10×ligationbuffer、5μL 20μg/μL Recombinant albumin、30μL 400U/μL T4DNA ligase；或，415μL无菌无酶水、100μL 10×ligation buffer、5μL 20μg/μLRecombinant albumin、30μL 400U/μLT4 DNA ligase。
8.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的Pore-C文库的构建方法，其特征在于，所述蔗糖密度梯度离心法为根据基因组大小确定离心力。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法，其特征在于：将植物组织研磨成细粉后加入到细胞核提取液中，同时进行dna与蛋白质交联，通过过滤和蔗糖密度梯度离心法得到细胞核沉淀；1×pbs清洗细胞核后用细胞核提取液重悬细胞核，进行percoll密度梯度离心后加入同等体积的0.25m蔗糖分离得到纯净细胞核；然后进行原位细胞核酶切、连接、解交联；后用dna提取液抽提2遍，取上清加入氯化钠、醋酸钠和无水乙醇获取dna。
2.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法，其特征在于，所述植物组织为各种龄期的新鲜或冷冻后的材料。
3.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法，其特征在于，所述细胞核提取液组成为：0.4m sucrose、10mm tris-hcl，ph 8、10mm kcl、0.5％triton x-100、10mm edta，ph 8、1％pvp40、0.25％β-mercaptoethanol、0.1mm pmsf。
4.根据权利要求1所述的适用于复杂多倍体植物的pore-c文库的构建方法，其特征在于，蔗糖梯度离心溶液组成为：1.7m sucrose、20mm tris-hcl，ph 8、2mm kcl、0.2％tritonx-100、2mm edta，ph 8、0.25％β-merc...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，张兴坦，王毅斌，宫雨晴，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：
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