食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染制造技术

本发明专利技术涉及食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染，具体涉及一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法。本发明专利技术提供的方法，包括：Ｉ）培养所述被病毒感染的细胞；ＩＩ）对培养得到的所述被病毒感染的细胞进行转染；其特征在于：在培养所述被病毒感染的细胞时添加抗病毒药物，在所述细胞被转染之前的一段时间内，培养基中不使用抗病毒药物。通过本发明专利技术的方法使在被病毒感染的细胞的扩增数量增加的基础上，使得细胞的病毒转染效率大大地提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法，更具体地说，涉 及一种提高被猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus, SFV)感染的成年食蟹猴骨髓间充质干细 胞的慢病毒转染效率。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是中胚层来源的具有多向分化能力 的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，是具有自 我复制、多向分化潜能的成体干细胞。在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成 肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力；同时，MSC还可以向 外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化。这突破了 MSC仅为中胚层干细胞的概 念，揭示了 MSC具有更为重要的理论研究意义和更为广阔的应用前景。骨髓MSC体外分离 培养容易获取，细胞免疫原性低，易于被外源病毒转染且表达稳定，已成为组织工程、基因 治疗和再生医学研究中理想的种子细胞。间充质干细胞的应用大多是通过细胞直接自体移 植或细胞体外扩增并自体移植的方式。 无论是利用骨髓MSC作为移植细胞或者基因工程的载体细胞，其治疗或使用的方 法以及效果和疗效都需要经过大量的实验进行验证。但以病患者为直接研究对象进行科学 研究受到诸多因素的制约，尤其是伦理学方面的限制。因此，需要首先在实验动物的身上确 定各种治疗方法的疗效。 在所有的实验动物中，普遍认为灵长类哺乳动物是与人类最接近的动物。食蟹猴 作为一种近年来大规模饲养的猴科灵长类哺乳动物，在各种治疗方法和药物的临床前实验 中，发挥越来越重要的作用。 在以食蟹猴为对象研究骨髓间充质干细胞的应用中，本专利技术人发现成年食蟹猴的 骨髓MSC在体外传代代数非常有限，细胞很快融合，在体外食蟹猴的骨髓MSC很难扩增到需 要的数量。成年食蟹猴的骨髓MSC体外培养不超过3代就出现大片的细胞融合。无法进行 细胞数量的扩增以及体外的基因工程改造的实验。而在某些成年多发疾病的研究中，作为 细胞移植治疗以及基因工程改造的材料，必须提供足够数量的成年骨髓MSC。 经研究发现，所述成年食蟹猴的骨髓MSC体外培养不超过3代就出现大片的细胞 融合现象的原因是因为它们感染了猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus, SFV)，在本专利技术人的 研究中发现，向成年食蟹猴的骨髓MSC的细胞培养基中添加抗逆转录病毒的药物可以使细 胞在体外培养10代以上，使细胞数量大大地扩增。 但在以成年食蟹猴的骨髓MSC为研究对象的基因工程试验中，本专利技术人发现在成年食蟹猴的骨髓MSC的培养基中添加抗逆转录病毒的药物又会使细胞在以逆转录病毒为载体进行病毒转染的过程中的转染效率大幅度地降低，从而无法进行相关的研究。 在对某些病毒感染疾病的转基因疗法的研究中，我们也需要对病毒转染的细胞进行病毒转染，来验证病毒转染的治疗对病毒感染的细胞的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是通过对被病毒感染的细胞的病毒转染方法的改进，使其转染 效率大幅度地提高。 为此，本专利技术提供了一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法，包括I) 培养所述被病毒感染的细胞；11)对培养得到的所述被病毒感染的细胞进行转染；其特征 在于在培养所述被病毒感染的细胞时添加抗病毒药物，在所述细胞被转染之前的一段时 间内更换培养基，更换的培养基中不使用抗病毒药物。 在一种优选的实施方式中，所述被病毒感染的细胞优选是被逆转录病毒感染的。 在一种优选的实施方式中，所述逆转录病毒优选是猴泡沫病毒。 在一种优选的实施方式中，所述被病毒感染的细胞优选是食蟹猴骨髓间充质干细 胞。 在一种优选的实施方式中，所述食蟹猴骨髓间充质干细胞优选是成年食蟹猴骨髓 间充质干细胞。 在一种优选的实施方式中，所述以病毒为载体的转染方法优选是以逆转录病毒为 载体的转染方法。 在一种优选的实施方式中，所述以逆转录病毒为载体的转染方法优选是以慢病毒 为载体的转染方法。 在一种优选的实施方式中，所述抗病毒药物优选为抗逆转录病毒药物。 在一种优选的实施方式中，所述抗逆转录病毒药物优选为泰诺福韦。 在一种优选的实施方式中，所述一段时间优选是2至8天。 应用本专利技术的方法，使感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞不仅能 够增殖达到足够的数量，还可以使病毒转染的效率大幅度地提高。另外，本专利技术的方法也可 以用于对某些病毒感染疾病的转基因治疗的研究中。附图说明 图1A示出了本专利技术实施例和对比例中使用的慢病毒载体转移质粒DUET101-GFP 的基因分布的概图(其中EF l-a和PGK是两个启动子结构，分别驱动GFP基因和潮霉素 抗性基因，还包括复制起点、长末端重复序列(LTR)和氨苄青霉素抗性基因)，图IB中示出 了本专利技术实施例和对比例中使用的包装质粒CMVA8.91的基因构建图，图1C中示出了本发 明实施例和对比例中使用的包装质粒PMD. G的基因构建图，图1D示出了本专利技术实施例和对 比例中使用的载体质粒DUET101的基因构建图。 图2A示出了本专利技术中使用的293T细胞在显微镜下所观察到的细胞的照片(放大 倍数为100倍)，图2B示出了在荧光显微镜下观察到的制备的慢病毒，图2C示出了在荧光 显微镜下观察到的慢病毒滴度鉴定的结果，图2D示出了通过流式细胞仪检测到的带有绿 色荧光蛋白的细胞百分比，横坐标GFP代表绿色荧光，图中十字右侧显示表达绿色荧光阳 性细胞，左侧表示阴性细胞；纵坐标PI表示红色荧光，十字上方为红色荧光阳性细胞，下方 为红色荧光阴性细胞，PI染色死亡细胞核。 图3示出了在对比例2中，在转染本专利技术中的慢病毒后，在不同时间点所观察到的细胞中GFP的阳性率。 图4示出了在对比例l和2以及实施例1中在病毒转染前的不同时间点停用泰诺 福韦进行病毒转染，所达到的有绿色荧光蛋白的细胞的百分比。 图5示出了在对比例1和2以及实施例1中分别在病毒转染前的第2天和第6天 停用泰诺福韦进行病毒转染后，在荧光显微镜下观察到的带有绿色荧光蛋白的细胞，其中 图5B和5G的放大倍数为200倍，图5C、图5D、图5E、图5H、图51和图5J放大的倍数为100倍。具体实施例方式本专利技术中使用的感染有病毒的细胞可以取自活的动物体或是刚刚处死的动物或 者可以是实验室自行冻存的细胞。在本申请的实施例中所使用的细胞就是专利技术人自己冻存 的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞。本专利技术的细胞也可以是猩猩等其他灵长类哺乳动物的细 胞。本专利技术的方法也可以用于对某些病毒感染疾病的转基因治疗的研究中。如艾滋病等其 他病毒感染疾病的转基因治疗中。 感染有病毒的细胞在培养的过程中，如果不添加抗病毒的药物，生长状况较差，而 且会很快融合，无法大量地增殖下去。当向这些细胞的培养基中添加抗病毒的药物会使细 胞的生长状况得到改善，但是添加抗病毒药物后，以病毒为载体进行病毒转染的效率会很 低。在本专利技术中，在进行病毒转染前的一段时间内，停止使用抗病毒药物，使病毒转染的效 率提高。 实施例1和对比例1和2 专利技术人以慢病毒为载体转染食蟹猴间充质干细胞，在实施例1中，使用的细胞是感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴细胞，分别在慢病毒转染前的2、4、6和8天停用抗逆转录病毒药物泰诺福韦，即在慢病毒转染前的2、4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法，包括：　　Ⅰ）培养所述被病毒感染的细胞；　　Ⅱ）对培养得到的所述被病毒感染的细胞进行转染；　　其特征在于：在培养所述被病毒感染的细胞时添加抗病毒药物，接着在所述细胞被转染之前的一段时间内更换培养基，该更换的培养基中不使用抗病毒药物。

【技术特征摘要】
一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法，包括I)培养所述被病毒感染的细胞；II)对培养得到的所述被病毒感染的细胞进行转染；其特征在于在培养所述被病毒感染的细胞时添加抗病毒药物，接着在所述细胞被转染之前的一段时间内更换培养基，该更换的培养基中不使用抗病毒药物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被病毒感染的细胞是被逆转录病毒 感染。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述逆转录病毒是猴泡沫病毒。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述被病毒感染的细胞是食蟹猴骨髓间 充质干细胞。5. 根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张愚，任振华，邹春林，王淑艳，岳峰，
申请(专利权)人：广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]