本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明专利技术提供了一种AFP磁微粒
化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明专利技术的试剂盒包括：
1)AFP校准品；2)抗异硫氰酸酯荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；
3)生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；
4)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；5)化学发光底物液；以及6)反应管。
进一步，根据本发明专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以AFP纯品配
制校准品；2)制备FITC抗体包被的磁微粒溶液；3)制备生物素标记的AFP
单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；4)用辣根过氧化物酶
标记链亲和素；5)配制化学发光底物液；6)分装上述校准品、磁颗粒溶液、
混合液、酶标记物、化学发光底物液和反应管；以及7)组装为成品。本发
明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术提供了一种宽范围、高灵敏 测定甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其制备 方法。本专利技术试剂盒结合了生物素一亲和素免疫放大技术、免疫磁微粒分离技术 和化学发光免疫分析技术。
技术介绍
癌症自从诞生之日起就对人类的生存健康构成了严重威胁。目前肿瘤治疗的 关键在于早期发现、早期治疗。但是目前医院诊断早期肿瘤，主要是靠影像学和 细胞病理学诊断技术， 一般都是在具有明显的占位性病变和临床症状后才得以确 诊，但这已不是癌变的最早期。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，以血液为代 表的体液蛋白质成为肿瘤标志研究领域中的热点。越来越多肿瘤标志物的发现对 建立发展快速、高灵敏、高特异肺瘤标志物新型检测技术提出了更高的要求。原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC， 又称为Primary liver cell carcinoma),是世界范围内第五大常见癌症，致命率居于第三位。在中国，肝癌 发病率是世界其它地区的三到四倍，占世界肝癌发病总数的40%多。目前报道的关 于HCC的肿瘤标志物有多种，其中以曱胎蛋白(AFP)最受关注。AFP是由一个天冬 酰胺连接到糖链上的一种糖蛋白，分子量大约为70000 Dalton，在胚胎发育阶段 由嬰儿的卵黄囊和肝脏大量分泌，婴儿出生后12~18个月内迅速减少，血清含量 低于10 |u g/L。血清学检测AFP作为HCC参照物已经被世界多家权威机构认可，包 括欧洲肝脏研究协会(EASL)、英国胃肠病学研究协会(Br Soc GE )、欧洲肺瘤 标志物组织(EGTM)和美国国立综合癌症网(NCCN)。并且AFP做为HCC诊断参考标准也受到美国NACB (National Academy of Clinical Biochemistry)的支持， 该机构强调曱胎蛋白检测并连续观察AFP在体内的变化情况对于早期诊断HCC具 有重要的临床价值。由于AFP在非肿瘤人群(如肝炎)或孕妇体内均有可能大幅升 高，所以宽范围的检测是必需的。例如AFP在100-300 jug/L之间者必须进行随访， 密切观察AFP的动态变化，注意可能的小肝癌；AFP在350-500 pg/L,或含量明 显增高者，必须参考其他;险查，高度警惕原发性肝癌的可能；AFP为500~1000 p g/L，且含量在短期内不断升高，原发性肝癌可能性很大，但必须建议做活检；AFP 大于IOOO jag/L者，甚至在近期内AFP含量迅速升高，则原发性肝癌诊断基本可 确定。所以高灵敏的检测是疾病早期预警的要求，而宽范围又是动态监测所必需 的。免疫学测定是以抗体-抗原的特异性识别、抗体标记技术和示踪技术为基础的 定量技术，在肿瘤标志物的体液检测中具有广泛应用。目前检测AFP的免疫学方 法主要有石英晶体微天平法、元素示踪ICP-MS法、空间分辨荧光法、乳液光度免 疫分析法、电化学免疫分析、毛细管电泳-化学发光检测。这些方法均具有不可避 免的不足之处如石英晶体微天平、ICP-MS价格昂贵，空间分辨荧光法易受到环 境的干扰，光度分析法检测灵敏度较低、毛细管电泳的重现性较差，而电化学免 疫分析又需要特殊的装置。同时这些方法的工作范围大多在0-600)jg/L之间，对 高浓度样品必须进行稀释方可测定，根本无法满足含量大于600 pg/L后的连续监 测。化学发光免疫分析法结合了免疫反应的高特异性和化学发光反应的高灵敏性， 仪器简单，成本低廉，可达到10-'8摩尔检测水平，且检测范围可达6个数量级， 因而得到了越来越多的关注。在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多， 一定程度上影 响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测 物，是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成6一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有 特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒，具有分离速度快、效率高、可重复性好；操作简单；不影响被分离细胞或其它生物材 料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成分 得以分离、浓集或纯化。免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大提高检测 的灵敏度和准确性，它以微米级磁微粒为载体，利用表面有机物提供的羧基活性 基团与蛋白质氨基共价结合，采用抗体进行搭桥成免疫磁微粒，可进行抗原、 抗体反应。该技术的新颖之处有(l)采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面 积，从而增加了抗体的有效包被量，不仅节省了抗体，而且有助于建立宽范围的 免疫检测方法，尤其适合于高浓度临床样本的测定，避免弯钩效应的发生；(2)利 用顺磁铁微粒为固相载体，外包被单克隆抗体，增加抗原、抗体的接触面积及底 物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结 合抗原-抗体与游离抗体的作用；(3)在液相反应中，使用发光增强剂，将水分子 从发光底物的发光位点排开，同时还可缩短发光的达峰时间；(4)使用单克隆抗体， 提高了反应的特异性。生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS )具有多级的信号放大作 用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性 强和实验成本低等特点。生物素-亲和素免疫放大技术可以直接用标记亲和素连接 生物素化大分子反应体系进行检测，这种方法称为标记亲和素-生物素法。待测反 应体系可以利用生物素化抗体，使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶 联，放大终反应先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标 准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再7加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分 析的灵敏度。化学发光免疫分析结合生物素-亲和素系统和免疫磁微粒固相分离体系是一 种检测AFP的先进而有效的方法，有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、 检测中的应用与发展。曾经有文献报道利用生物素-亲和素系统的信号放大原理实 现对AFP的荧光免疫检测，但与化学发光检测及磁微粒系统结合建立高灵敏、宽 范围的方法则未见报道。并且现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全 自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使 用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本专利技术是在酶免疫分析的基础上应 用酶催化发光底物，通过;f企测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底 物，因而其灵敏度大大提高，并且操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自 动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量、快检测，使用 成本低，更易推广应用。
技术实现思路
本专利技术同时解决了上述问题，即将生物素-亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒 技术结合化学发光免疫分析技术，检测AFP，提供了一种高灵敏、宽范围、简便快 速、稳定地定量检测AFP的测定试剂盒，该试剂盒适于产业化，具有良好的市场 应用前景。本专利技术的目的是提供一种生物素一亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结 合化学发光免疫分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： １）ＡＦＰ校准品； ２）抗异硫氰酸荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）单克隆抗体包被的磁微粒溶液； ３）生物素 标记的ＡＦＰ单克隆抗体与ＦＩＴＣ标记的ＡＦＰ单克隆抗体的混合液； ４）辣根过氧化物酶标记的链亲和素； ５）上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液；以及 ６）反应管。
【技术特征摘要】
1、一种甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)AFP校准品；2)抗异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；3)生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；4)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；5)上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液；以及6)反应管。2、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的AFP单克隆 抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合比例为1: 2。3、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包含A 液和B液，其中，A液是0. 1M pH值为8. 5的Tris-HCl緩冲液，包含4. Omg/mL的鲁米诺或异 鲁米诺和0. 3mg/mL的对硤苯酚；B液是0. 1M pH值为4. 6的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。4、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的反应管 材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。5、 一种制备权利要求l所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤 1)以AFP纯品配制^f交准品；2) 制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒；3) 制备生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；4) 以辣#>过氧化物酶标记链亲和素；5)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；6) 分装上述校准品、磁颗粒溶液、混合液、酶标记物、化学发光底物液 和反应管；以及7) 组装为成品。6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制备抗F...
【专利技术属性】
技术研发人员：王栩，张倩云，林金明，李振甲，应希堂，胡国茂，
申请(专利权)人：王栩，张倩云，林金明，李振甲，应希堂，胡国茂，
类型：发明
国别省市：11
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