【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组ⅰ型马立克氏病病毒株及其构建方法与应用，特别涉及一种表达h9n2亚型禽流感病毒ha基因的重组马立克氏病病毒rmdv-ha及其构建方法与应用。本专利技术属于生物。
技术介绍
1、研究表明，h9n2亚型aiv是目前鸡群中流行最广泛的aiv亚型。由于其会降低产蛋率或与其他病原体混合感染导致鸡群发生呼吸道病，引起高死亡率，给养禽业造成了巨大的经济损失。虽然h9n2亚型aiv直接感染人类的病例不多，但其常与其他多种亚型aiv重新组合，进而威胁人类的生命安全。由于h9n2亚型aiv对养禽业的威害及公共健康的潜在威胁，使得针对h9亚型aiv的防控意义更为突出。
2、马立克氏病病毒（marek’s disease virus, mdv）主要引起鸡的马立克氏病（marek’s disease, md）。md是一种淋巴组织增生性肿瘤病，其特征为患鸡的外周神经淋巴细胞浸润和增大，引起肢翅麻痹，以及性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤的单核细胞浸润和肿瘤。本病在鸡群中有较高的发病率和死亡率，给养鸡业造成了巨大的经济损失，世界各国均把该病视为危害养鸡业最重要的疾病之一。
3、mdv属于疱疹病毒科，可分为三种不同的血清型，其中ⅰ型mdv可以致瘤，ⅱ型是来自鸡的非致瘤病毒，ⅲ型是来自火鸡的非致瘤病毒（hvt）。疫苗是控制该病的主要手段，近年来随着mdv更强毒力毒株的出现，尤其是特超强毒的出现，现有的疫苗毒株包括被广泛使用的hvt和cvi988不能对其提供良好的保护。因此迫切需要研制新的md疫苗毒株来有效防控该病。ⅰ型
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒rmdv-ha及其构建方法与应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
3、本专利技术的一种表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株，是将包含sv40启动子、h9n2亚型aiv ha基因及终止子序列的基因片段sv40-ha插入马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株的ul41基因内部后获得的。
4、其中，优选的，所述的马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株为rmsδmeq株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号是：cgmcc no.4612。
5、其中，优选的，表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株是将包含sv40启动子、h9n2亚型aiv ha基因及终止子序列的基因片段sv40-ha插入马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株的ul41基因内部，并替换rmsδmeq株基因组序列的96927-97106位核苷酸序列后获得的。
6、其中，优选的，所述的h9n2亚型aiv为a型流感病毒a/chicken/guangxi/s11583/2019(h9n2)病毒株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no .v202333。
7、其中，优选的，所述的基因片段sv40-ha的核苷酸序列如seq id no.12所示。
8、进一步的，本专利技术还提出了一种构建所述的表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株的方法，包括以下步骤：
9、（1）马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株的反向遗传操作系统的构建
10、所述的反向遗传操作系统包含5个黏粒，所述的黏粒是将马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株的基因片段克隆入pcc1fos中得到，得到的5个黏粒分别含有马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株基因组1-47178位、42801-87422位、87223-125265位、121752-159339位和159189-177526位核苷酸序列，分别依次命名为pms-1、pms-2、pms-3、pms-4以及pms-5，其中pms-3包含rmsδmeq株的ul41基因；所述的马立克氏病病毒 meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株的基因组序列的genbank登录号为jq314003.1；
11、（2）表达ha基因的重组黏粒的构建及鉴定
12、使用两步red重组的方法进行重组黏粒的构建：将pms-3黏粒转染到含有pred e/t表达质粒的感受态细胞中制备为感受态；以rpsl-neo表达盒dna为模板，用引物ul41-rpslf/r经pcr扩增获得含有ul41插入位点两端同源臂的rpsl-neo基因片段，将其纯化后转染至含有pms-3的感受态细胞并制备为感受态；以含有h9n2亚型aiv ha基因的表达质粒为模板，用引物ul41-sv40 f/r经pcr扩增获得含有ul41插入位点两端同源臂的sv40-ha基因片段，将其纯化后转染至含有rpsl-neo的感受态细胞中，挑取阳性菌落扩大培养后提取黏粒，将获得的黏粒命名为pms-ha；涉及的引物的核苷酸序列如下所示：
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14、（3）重组病毒拯救
15、提取pms-1、pms-2、pms-ha、pms-4、pms-5五个黏粒dna；通过磷酸钙转染方法将上述五个黏粒共转染次代cef，4 d~5 d后，观察转染的细胞是否出现mdv特异性蚀斑病变；出现蚀斑后收获病毒，并在cef细胞中连续传代并保存；提取重组病毒的基因组dna，同时设亲本病毒基因组dna对照，利用引物ha-f/r经pcr鉴定，并测序鉴定，鉴定正确的重组病毒即为表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株，命名为rmdv-ha;
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17、其中，优选的，所述的含有h9n2亚型aiv ha基因的表达质粒是将a型流感病毒a/chick本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，是将包含SV40启动子、H9N2亚型AIV HA基因及终止子序列的基因片段SV40-HA插入马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的UL41基因内部后获得的。
2.如权利要求1所述的表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，所述的马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株为rMSΔMeq株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号是：CGMCC No.4612。
3.如权利要求2所述的表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，是将包含SV40启动子、H9N2亚型AIV HA基因及终止子序列的基因片段SV40-HA插入马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株rMSΔMeq株的UL41基因内部，并替换rMSΔMeq株基因组序列的96927-97106位核苷酸序列后获得的。
4.如权利要求3所述的表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病
5.如权利要求4所述的表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，所述的基因片段SV40-HA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
6.一种构建权利要求2-5任一项所述的表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含有H9N2亚型AIV HA基因的表达质粒是将A型流感病毒A/chicken/Guangxi/S11583/2019(H9N2)病毒株的HA基因进行密码子优化后克隆入载体pcDNA3.1的SV40表达盒中得到的，其中，包含SV40启动子、A型流感病毒A/chicken/Guangxi/S11583/2019(H9N2) HA基因及终止子序列的基因片段SV40-HA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
8.权利要求1-5任一项所述的表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒株在制备同时预防H9N2亚型AIV以及马立克氏病病毒感染的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物为表达H9N2亚型AIV HA基因的重组MDV活载体疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种表达h9n2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，aiv）ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，是将包含sv40启动子、h9n2亚型aiv ha基因及终止子序列的基因片段sv40-ha插入马立克氏病病毒meq基因缺失疫苗株的ul41基因内部后获得的。
2.如权利要求1所述的表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，所述的马立克氏病病毒meq基因缺失疫苗株为rmsδmeq株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号是：cgmcc no.4612。
3.如权利要求2所述的表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，是将包含sv40启动子、h9n2亚型aiv ha基因及终止子序列的基因片段sv40-ha插入马立克氏病病毒meq基因缺失疫苗株rmsδmeq株的ul41基因内部，并替换rmsδmeq株基因组序列的96927-97106位核苷酸序列后获得的。
4.如权利要求3所述的表达h9n2亚型aiv ha基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒株，其特征在于，所述的h9n2亚型aiv为a型流感病毒a/chicken/guangxi/s11583/2019(h9n2)病毒株，保藏在中国典型培养物...
【专利技术属性】
技术研发人员：高玉龙，陈化兰，陈运通，曾显营，刘长军，田国彬，张艳萍，邓国华，施建忠，包红梅，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：
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